III RESULTATS
III.2 Diversité génétique
Les résultats obtenus avec le logiciel GENETIX 4.05 montrent des taux de diversité assez élevés (71%) (Polymorphisme inter-population). Le taux de polymorphisme le plus élevé est enregistré avec le locus gwm131 (75.37%) suivi de
gwm 427 (70.76%) puis le locus gwm135 (66.67%). Cependant, le taux de
polymorphisme intra-population était moins élevé (0.14 %). Le locus gwm131 donne le taux le plus élevé (31.06%) suivi de gwm427 (12.28%), le taux polymorphisme intra-spécifique était nul avec le locus gwm135.
Le nombre d’allèle varie de 1 à 3 chez la population Djenah Khetifa et de 1 à 2 pour les deux populations Oued Zenati et Waha. Le locus gwm131 présente 6 allèles, 4 allèles pour le locus gwm427, seul le locus gwm135 présente un nombre d'allèles sensiblement plus faibles (Tableau 16).
Le tableau 16 présente aussi les fréquences et les tailles des allèles des différentes populations. Les fréquences alléliques calculées pour chaque locus et chaque population varient de 0 à 0,89. Au niveau du locus gwm131, qui compte six allèles, la dominance de l’allèle 139 est assez remarquable et sa fréquence est de 0.324 dans les trois populations. Quant au locus gwm135, il exhibe trois allèles au total ; un allèle pour chaque individu. Pour le locus gwm427, la dominance de l’allèle 194 chez Waha est assez remarquable et sa fréquence est de 0.8.
La matrice des distances génétiques estimées entre individus (Tableau 17) indique des valeurs élevées entre les populations prises deux à deux. Ces distances varient de 0.83 à 1.67. La matrice de distance génétique indique que les trois populations présentent une dissemblance génétique. Cependant, les variétés Djenah Khetifa et Waha semblent êtres plus proches génétiquement.
Chapitre III Caractérisation moléculaire de la variation somaclonale chez des somaclones de blé dur (Triticum durum Desf) par marqueur SSR.
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Tableau 16 Fréquences alléliques de chaque population étudiée.
Locus Allèles (pb) Populations Djenah Khetifa Oued Zenati Waha gwm131 (N) 12 9 5 136 0.000 0.111 0.000 139 0.083 0.889 0.000 151 0.083 0.000 0.000 155 0.833 0.000 0.000 156 0.000 0.000 0.200 157 0.000 0.000 0.800 gwm135 (N) 12 9 5 146 0.000 1.000 0.000 148 1.000 0.000 0.000 173 0.000 0.000 1.000 gwm427 (N) 12 9 5 194 0.000 0.000 0.800 222 0.000 0.000 0.200 223 1.000 0.000 0.000 225 0.000 1.000 0.000
Tableau 17 Distance génétique entre les trois populations de blé dur.
Djenah Khetifa Oued Zenati Waha
Djenah Khetifa 0
Oued Zenati 1.16 0
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IV DISCUSSION
Les différences dans les longueurs de séquences des produits d'amplification retrouvées chez les somaclones R1 sont expliquées par l’induction de variation somaclonale. Ces variations génétiques, constatées dans la première génération, suggèrent que de telles modifications ont été transmises dans la descendance des régénérants. La transmission des caractères variants de cellules à cellules par mitose ainsi que l'héritabilité cellulaire des variations est aujourd'hui bien établie (Meins 1983). Selon Meins (1983) les changements qui résultent de modifications permanentes du génome sont génétiques, ces changements sont transmissibles chez les plantes régénérées et dans leur descendance selon les règles de la ségrégation mendélienne classique.
La perte ou le gain d'une bande peut être dû à des altérations génomiques telles qu'une mutation dans le site d'amorçage ou une délétion / insertion entre les sites d'amorçage (Jin et al. 2008). Les résultats obtenus sont en accord avec les travaux de Khan et al. (2013) réalisés sur des vitroplants d’armoise (Artemisia amygdalina) régénérées in vitro. Ces auteurs ont identifié deux nouveaux allèles de 0.15 kb et 0.2 kb par marqueurs ISSR. Nos travaux concordent également avec d’autres travaux réalisés sur différentes espèces telle que le peuplier faux-tremble (Rahman et Rajora 2001), le riz (Khai et Lang 2005) et le coton (Jin et al. 2008).
Les facteurs pouvant influencer la variation somaclonale peuvent être multiples, en l'occurrence la nature du génotype, l’âge de la culture, la composition des milieux de culture (Larkin 1984, Duncan 1997, Kaeppler et al. 2000). D’après nos résultats, il semble que la présence de l’agent sélectif PEG20% soit à l’origine des variations génotypiques identifiées puisque la majorité des variations avaient été observées sur des plantes qui ont pour origine un cal stressé. Nag et al. (2004) rapportent que le changement dans le nombre des unités de répétitions peut altérer la fonction et/ou le profil d'expression d'un gène, ceci en fonction de la position du locus SSR.
Bien que la majorité des somaclones soit phénotypiquement normale et identique aux plantes mères, des mutations de types insertion et/ou délétion ont été mises en évidence par les marqueurs gwm 131 et gwm 427. L'identification
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phénotypique, basée sur une description des traits morphologiques, est facilement identifiée mais certains changements induits par culture in vitro ne peuvent pas être facilement observés. Des constatations similaires sur des régénérants phénotypiquement normaux ont été évoquées chez d'autres espèces (Rahman et Rajora 2001, Jin et al. 2008).
La distance nulle entre deux individus suggère une similarité vis-à-vis des loci étudiés. Par contre une distance élevée traduit la diversité génétique d’un individu à un autre (Patade et al. 2006). La matrice de distance génétique indique que les trois populations étudiées présentent une dissemblance génétique.
Les fragments monomorphes obtenus confirment l’homogénéité génétique des plantes mères pour les marqueurs étudiés (Zhang et al. 2010, Manoj et al. 2012).
Les individus des trois populations montrent un polymorphisme génétique plus grand par rapport à ceux des individus de la même espèce ; on a donc une diversité interspécifique qui est très grande par rapport à la diversité intraspécifique. Ce qui traduit une isolation génétique importante entre les variétés étudiées et amplifiées par la nature même de la reproduction fermée chez le blé. Le polymorphisme intra-spécifique observé est dû, en partie, à la différence de taille des bandes obtenues avec les locus
gwm 131 et gwm 427. Ces résultats révèlent aussi que les marqueurs monomorphes SSR
peuvent être utiles pour l'analyse génétique (Hama-Ali et Tan 2014).
Nos résultats sont en accord avec les travaux de Medini et al. (2005) et ceux de Colomba et Gregorin (2011) effectués sur différentes populations de blé dur et qui ont montré l’existence d’une forte variabilité interspécifique par l’utilisation des marqueurs SSR et AFLP.
Dans une étude de référence, Hamrick et Godt (1997) montrent que la diversité génétique intrapopulation chez les espèces allogames varie entre 10.3% et 26.6% alors que la diversité génétique intrapopulation des espèces autogames varie entre 0.09% et 0.14%.
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V. CONCLUSION
Cette étude a montré que les marqueurs SSR peuvent être utilisés efficacement
pour l'évaluation de la variation somaclone parmi des plantes dérivées de culture
in vitro. La fréquence de la variation somaclonale semble être en relation avec l’agent
sélectif, ce qui suggère que la simulation du stress hydrique, in vitro, par le PEG est capable de variation génétique. La présente étude aura également permis de mettre en évidence un niveau élevé de diversité génétique (71%) chez les trois populations de blé dur. L’existence de variation somaclonale permet d'augmenter la variabilité au sein des populations. Les variations retrouvées chez les plantes de première génération impliquent que ces modifications ont été transmises par reproduction sexuée en l’absence de stress hydrique. Néanmoins, la réalisation de test de stabilité dans les générations qui suivent et en présence de stress hydrique permettrait de vérifier la sélection ou non de variants somaclonaux tolérant au stress hydrique.
Les plantes sélectionnées pourraient être utilisées comme ressources génétiques, et leur caractérisation en condition de stress hydrique permettra de mieux comprendre
les mécanismes impliqués dans la tolérance au stress hydrique. Dans la section qui suit,
nous aborderons une nouvelle approche d’analyse protéomique pour l’identification et la caractérisation de protéines candidates répondants au stress hydrique. Des analyses
par RT-PCR quantitative et Western blot sont ensuite réalisées afin de confirmer les gènes candidats identifiés sous condition de stress hydrique.