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Synthèse bibliographique

II. MATÉRIEL ET MÉTHODES 1 Matériel végétal

Les trois variétés de blé dur (Triticum durum Desf.) utilisées dans la présente étude nous ont été fournies gracieusement par l’Institut Technique des Grandes Cultures (ITGC) de Constantine. Leurs principales caractéristiques sont les suivantes :

- La variété Djenah Khetifa, variété population sélectionnée depuis les premiers botanistes, résiste à différentes maladies et présente une bonne tolérance à la sécheresse. Elle présente une bonne productivité avec une bonne qualité semoulière.

- La variété Oued Zenati provient de la station de Guelma 1936.H, variété tardive avec une bonne qualité semoulière, elle est assez bonne tolérance à la sécheresse.

- La variété Waha provient du Centre Internationale d'Amélioration du maïs et du blé du Mexique (CIMMYT). Elle a été introduite en Algérie au niveau de l'Institut Technique de Grandes Cultures (ITGC) de Sétif par l'intermédiaire du Centre Internationale de la Recherche Agricole en Zones Arides (ICARDA). Waha est une variété précoce, sensible à la sécheresse et aux gelées printanières.

II.2 Induction de la callogenèse et conditions de culture

La désinfection est une étape clé pour réussir les cultures in vitro. Les grains sont désinfectés par passage 60 secondes dans l'éthanol 70° et 20 minutes dans l'hypochlorite de calcium 7 %, puis débarrassés de l'hypochlorite par 5 rinçages successifs à l’eau distillée stérile.

Les cals sont initiés à partir d’embryons matures et cultivés sur milieu MS (Murashig et Skoog 1962), additionné à 2 mg l-1 de 2,4-D, 30g de saccharose et 2,5 g l-1

de Phytagel (Sigma-Aldrich). Le pH du milieu a été ajusté à 5,7 avant autoclavage à 110 ° C pendant 30 min. Les cultures sont incubées à 25 ± 1°C pendant 30 jours avec

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II.3 Sélection au niveau cellulaire

Les polyéthylènes glycols, avec la formule générale HCH2(OCH)nOH, sont des polymère neutres, stables, non toxiques et hydrosoluble. Ils sont disponibles dans une large gamme de poids moléculaires et sont utilisés pour simuler un stress hydrique d’une manière semblable au séchage du sol. Ils rendent ainsi l’eau peu accessible à la cellule (Heyser et Nabors 1981, Ranjbarfordoei et al. 2001, Matheka et al. 2008, Meng et al. 2016).

Dans notre expérience, nous avons appliqué deux niveaux stress induits par le PEG 6000 (Merck, Germany); 10%(SI) et 20% (SII) générant des niveaux de stress osmotique respectifs de l’ordre de -0,49MPa et -1,2MPa. Le stress osmotique est appliqué en phase d'initiation des cals.

Les pressions osmotiques ont été déterminées à l’aide d’un osmomètre à pression de vapeur (Fiske® osmometer).

La soumission graduelle des cellules végétales à un stress est inefficace dans la sélection des variants tolérants (Lutts et al. 1996). Ceci parce que les cellules non tolérantes peuvent entreprendre une adaptation par épigénie au gradient du stress imposé (Lutts et al. 1996). Par conséquent cette adaptation voile la sélection des génotypes porteurs de la tolérance d'origine génétique (Lutts et al. 1996) ; c’est la raison pour laquelle notre choix s’est porté sur l’application brutale du stress hydrique.

II.4 Régénération des plantes et acclimatation

Les cals embryogènes survivants sur les milieux contenant 0%, 10% et 20% de PEG 6000 ont été transférés dans des tubes à essai contenant le milieu de base MS

(Murashig et Skoog 1962) additionné à 1.0 mg l-1 de BAP, 0.5 mg l-1 d’AIA, 30 g l-1 de saccharose et 2 g l-1 de Phytagel. Les cultures ont été maintenues sous une

photopériode de 16 heures, à température de 25 ± 1°C.

Les vitroplants fortement enracinés sont débarrassés soigneusement du milieu de culture, puis transférés dans des pastilles de tourbe (système Jiffy) contenant un

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mélange de terre et de sable (2: 1) puis placés à l’intérieur de dessiccateurs (Figure 5) pendant une à deux semaines avant d’être acclimatés en serre.

Figure 5 : Transfert des vitroplants dans des pastilles de tourbe (Système Jiffy).

II.5 Variables mesurées

Un test efficace pour identifier les géniteurs tolérants au stress hydrique est indispensable pour le succès de tout programme visant ce type d’amélioration. Plusieurs critères sont donc considérés afin de mettre en évidence l’effet du stress hydrique sur l’induction et le déroulement du processus de la callogenèse et de la régénération.

-Temps d’initiation de cals (TIC): Ce paramètre consiste à mesurer la durée nécessaire (jours) entre l’inoculation et l’apparition du premier cal, l’observation est faite sous binoculaire.

-Efficacité de le callogenèse (EC): La réactivité des embryons représente le nombre total d'embryons matures produisant des cals par rapport au nombre total d'embryons matures inoculés. La mesure est effectuée après 30 jours de culture.

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-Surface de croissance des cals (SCC): La prolifération des cals a été estimée par mesure de la surface moyenne (mm2) qui représente la somme totale des surfaces de cals mesurées au 7ème, 15ème et 30ème jours par le logiciel Image Pro Plus (Delporte et al. 2001, Kacem et al. 2016) (Figure 6).

Figure 6 : Mesure de la surface des cals par le logiciel Image Pro Plus (Delporte et al. 2001, Kacem et al. 2016).

-Tolérance relative (TR): Ce paramètre est mesuré selon la formule suivante: (Surface de croissance des cals cultivés sous stress hydrique / Surface de croissance des cals en absence de stress hydrique) x 100 (Abdelsamad et al 2007).

-Production de cals embryogènes (PCE): Ce paramètre est mesuré selon la formule suivante : (Nombre de cals embryogènes / Nombre total de cals cultivés) x 100

-Régénération de Plantes (RP): Ce paramètre est mesuré selon la formule suivante : (Nombre de plantes régénérées / Nombre totales de cals embryogènes) × 100

-Efficacité de la régénération (ER): Ce paramètre est mesuré selon la formule suivante : (Nombre de plantules obtenues / Nombre totale d’embryons matures cultivés) x 100.

II.6 Analyse statistique

Les données ont été standardisées à cinq répétitions, à raison d’une boite de Pétri par répétition et 20 embryons par boite.

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Les données quantitatives ont été traitées par les logiciels MINITAB17, SPSS20 et XLSTAT2015. Les tests statistiques ont été évalués à partir du test de Fisher noté F et du seuil de probabilité qui lui est associé, noté p. Les moyennes des variables mesurées ont été groupées par le test de NEWMAN-KEULS au seuil de 0.1 %, 1% et 5%. La classification hiérarchique (Cluster) a été réalisée en utilisant la méthode de Ward et la distance euclidienne (Morey et al. 1983, Vachon et al. 2005).