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II. 1 Matériel végétal et condition de culture

Le matériel végétal utilisé pour cette étude est constitué des vitroplants (R0) des trois variétés de blé dur (Djenah Khetifa, Oued Zenati et Waha) décrites dans le chapitre précédent.

Rappelons que nous avons retenu la concentration de 20% PEG comme pression de sélection car cette concentration avait réduit plus de la moitié des valeurs enregistrées de tous les caractères étudiés.

Les épis formés des vitroplants (R0) on été laissés en autofécondation et couverts par des sacs en plastique dont l’extrémité inferieur est fermée à laide d’un

fin ruban pour assurer le maintien d’un maximum d’humidité et éviter la pollinisation accidentelle. Les grains de la génération R0 ont été mis en germination sur papier filtre imbibé d’eau distillée stérile. Les jeunes plantules sont ensuite acclimatées en serre pour obtenir la première génération de plantes (Figure 14). Du point de vue morphologique, les somaclones R1 sont identiques aux plantes mères à l’exception d’un seul somaclone issu de cal stressé de la variété Oued Zenati. (Figure 14.B).

Pour des raisons de temps, nous avons restreint notre analyse à quelques somaclones de la première génération. Le nombre de plantes analysées ainsi que leurs origines sont présentés dans le tableau 13.

Tableau 13. Nombre et origine des somaclones R1 analysés.

Génotypes

Origine des plantes de la première génération Cals contrôle (0% PEG) Cals stressé (20% PEG) Djenah Khetifa 6 5 Oued Zenati 6 2 Waha 3 1

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Figure 14. Plantes de la génération R0 en phase épillaison. A. plantes issues de cals non stressés B. Plante issue de cals stressé (20 % PEG).

II. 2 Extraction de l’ADN génomique

L’ADN génomique des plantes de la première génération a été extrait à partir de cinquante milligrammes de feuilles récoltées. Pour l’ADN génomique des plantes

mères nous avons utilisé 25 embryons matures pour chaque génotype. Le protocole

d’extraction d’ADN utilisé est celui décrit par Doyle et Doyle (1990) (Annexe 2). 2µl de ARNase sont ajouté, pour l’élimination de toute trace d’ARN.

La qualité des échantillons d’ADN extraits a été contrôlée par électrophorèse sur gel d’agarose à 0.8%. La quantification des acides nucléiques a été effectuée par un nano spectrophotomètre (Nanodrop) (IMPLEN, Germany) pour deux longueurs d’ondes (280nm et 260nm). Plus le rapport DO260/DO280 tant vers 2.0, plus l’extrait d’ADN est qualifié de meilleur ou pur et son utilisation dans plusieurs techniques d’amplification est vouée au succès.

II. 3 Amorces microsatellites

Nous avons utilisés cinq marqueurs microsatellites, gwm088, gwm131, gwm135,

gwm186 et gwm427, développés initialement pour le blé tendre (Röder et al. 1998). Ces

marqueurs ont été sélectionnés selon leur disponibilité au laboratoire tout en considérant leurs caractéristiques techniques (bonne aptitude à l’amplification et interprétation aisée

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Chaque amorce sens (Forward) est marquée avec un fluorochrome (IRD800), grâce auquel les échantillons sont détectés lors de leur migration sur le séquenceur. Les caractéristiques principales des marqueurs microsatellites sélectionnés sont présentées sur le tableau 14.

Tableau 14 Caractéristiques des marqueurs microsatellites étudiés (Röder et al. 1998).

Locus Chromo-some

Séquence amorce (5'-3') F/R Motif de répétition

Tm

gwm131 1B-3B AAT CCC CAC CGA TTC TTC TC F (CT)22 60°C

gwm131 AGT TCG TGG GTC TCT GAT GG R

gwm135 1A TGT CAA CAT CGT TTT GAA AAG G F (GA)20 60°C

gwm135 ACA CTG TCA ACC TGG CAA TG R

gwm427 6A AAA CTT AGA ACT GTA ATT TCA GA F (CA)31 CA)22 50°C

gwm427 AGT GTG TTC ATT TGA CAG TT R

gwm088 6B CACTACAACTATGCGCTCGC F (GT)18TT (GA)4 60°C

gwm088 TCCATTGGCTTCTCTCTCAA R

gwm186 5A CACTACAACTATGCGCTCGC F (GT)18TT (GA)4 60°C

gwm186 TCCATTGGCTTCTCTCTCAA R

II.4 Conditions d’amplification des marqueurs microsatellites

Le volume réactionnel utilisé pour chaque échantillon est de 20 µl contenant 20ng d’ADN matrice, tampon 1X, 0.2 mM de chaque dNTP, 1.5mM MgCl2, 1µl/µl BSA, 0.25 µM de chaque amorces et 0.5U de Taq DNA polymerase (Fermentas).

Le programme d'amplification se compose des étapes suivantes : 4 minutes à 94°C pour une dénaturation initiale suivie de 30 cycles successifs, chaque cycle

comprend une succession de trois phases, une dénaturation à 94°C pendant 1 minute, une phase d’hybridation pendant 1 minute à la température d'hybridation spécifique de chaque paire d'amorces (Tableau 14) et une extension de 2 minutes à 72 °C. Enfin, une dernière étape d’élongation à 72 °C pendant 10 minutes est programmée suivie d’une

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phase de refroidissement à 4 °C. Les réactions de PCR sont réalisées dans un thermocycleur (Bio-Rad iCycler).

L’analyse des produits d’amplification est réalisée par électrophorèse sur gel d’agarose à 1.2 % dans du tampon TBE 0,5X à un voltage constant (de 100 V). Le gel contient le Roti-GelStain (ROTH) agent, non mutagène, intercalant des acides

nucléiques qui fluoresce sous un rayonnement ultraviolet à une longueur d’onde de 520 nm. Le gel est photographié dans une chambre noir sur la table UV à l’aide du

dispositif Quantum ST4-1100 (Vilber Lourmat, France) (Figure 15).

Figure 15. Test des amorces gwm131, gwm135, gwm427, gwm088 et gwm186 sur ADN génomique des génotypes de blé dur par PCR classique. M : marqueur de taille moléculaire (1kb DNA Ladder- Invitrogen).

II.5 Migration des produits PCR sur gel de polyacrylamide sur le séquenceur LI-COR.

Les échantillons contenus dans la plaque de réarrangement sont d’abord dénaturés dans le thermocycleur à 95°C pendant 2 minutes. Le réarrangement des plaques consiste à faire du multiplexage, c'est-à-dire à mélanger les microsatellites qui ont été amplifiés par PCR permettant la migration simultanée des marqueurs étudiés (Annexe 3). La plaque est immédiatement placée sur glace afin d’éviter toute renaturation éventuelle de l’ADN.

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Les fragments d’ADN sont ensuite chargés (0.8µl) sur un gel de polyacrylamide (25cm de longueur et 0.25mm d’épaisseur ; 20 ml d’acrylamide à 6,5%, 15 µl de TEMED sigma, 150 µl d’APS 10%) à un haut voltage (1500V) pendant 1h25. La migration et l’acquisition de l’image du gel se font grâce au LI-COR global edition IR2 DNA sequencer (Westburg).

Le principe de la technique consiste à détecter les produits PCR fluorescents par des lasers qui transmettent l’image des bandes au serveur. La visualisation de la migration est possible sur un ordinateur connecté au séquenceur.

Toutes les manipulations de la PCR jusqu’au dépôt des produits d’amplification sur le gel d’acrylamide sont réalisées à l’abri de la lumière.

II.6 Analyse statistique des données

L’image brute des gels est exportée sur un logiciel d’analyse Gene ImagIR, v 4.03 (Westburg) afin d’obtenir l’assignation de taille des allèles sur la

base d’une comparaison avec un marqueur de taille (350pb) (Fermentas).

Le nombre moyen d’allèle par locus, la diversité génétique totale (Ht), la diversité génétique intrapopulation (Hs), ont été étudiés à l'aide du logiciel GENETIX (Belkhir et al. 2004). Les distances génétiques entre paires de populations ont été calculées selon l’approche classique basée sur les fréquences alléliques dans chaque population en retenant la distance de Nei (1978) par le logiciel GENETIX v.4.02 (Belkhir et al. 2004).

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Figure 16. Séquenceur d’ADN- LI-COR global édition IR2 DNA sequencer (Westburg) (Photographie du CRA-W).

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