3. RÉSULTATS: PREMIÈRE PARTIE: ETUDE DE L’INFLUENCE DU NOMBRE
3.5. Distribution tissulaire des MSC après injection intraveineuse chez la souris NOD/SCID 57
La distribution des MSC dans plusieurs tissus a été testée avec des MSC de passage 3 ou 7. Des souris âgées de 2 mois et irradiées à 3 Gy ont reçu 2 105 MSC de passage 3 ou 7 par injection intraveineuse dans la queue. Après 24 heures ou 5 semaines, les souris ont été euthanasiées et le sang, la moelle osseuse, la rate, les poumons, le foie, les reins et l’intestin grêle ont été récoltés pour une analyse de l’ADN de l’albumine humaine par PCR en temps réel. Vingt-quatre heures après l’injection de MSC de passage 3, la moelle osseuse, l’intestin grêle, le foie et les
Résultats
58 poumons étaient positifs pour l’albumine humaine chez au moins une souris par groupe de 4 (Tableau 9). Les autres tissus étaient négatifs chez toutes les souris.
Toutes les souris étaient positives pour les poumons et nous avons observé une accumulation d’approximativement 10 fois plus de MSC dans les poumons comparés aux autres tissus. Après 5 semaines, seule la moelle osseuse était positive chez toutes les souris. Les autres organes étaient négatifs sauf chez une souris pour l’intestin grêle. Les MSC de passages précoce (P3) et tardif (P7) avaient une distribution tissulaire similaire. Ces résultats suggèrent que les MSC, quel que soit le nombre de passages, sont d’abord piégées dans les poumons avant d’atteindre d’autres organes tels que l’intestin grêle ou la moelle osseuse. Dans la moelle osseuse uniquement, les MSC sont capables de survivre jusqu’à 5 semaines.
Tableau 9: Distribution des MSC dans plusieurs tissus après injection intraveineuse.
Souris positives/souris greffées Nombre de passages des MSC utilisées
P3 P7
Temps après greffe
Tissus 24 heures 5 semaines 24 heures 5 semaines
Sang 0/1 0/3 1/3 0/4
Moelle osseuse 1/4 3/3 2/4 4/4
Rate 0/4 0/3 0/4 0/4
Rein 0/4 0/3 0/4 0/4
Intestin grêle 3/4 0/3 2/4 1/4
Foie 1/4 0/3 0/4 0/4
Poumon 4/4 0/3 4/4 0/4
Les souris NOD/SCID ont été injectées en intraveineuse avec des MSC récoltées au passage 3 ou 7.
L’albumine des MSC a été détectée par PCR en temps réel 24 heures ou 5 semaines après transplantation.
3.6. Discussion de la première partie
Des essais cliniques récents indiquent que les MSC pourraient être utiles pour prévenir et/ou traiter la maladie du greffon contre l’hôte et promouvoir la prise de greffe des cellules du donneur après transplantation de HSC (Le Blanc et al, 2008;
Koc et al, 2000). Les procédures utilisées pour préparer les MSC pour l’application clinique sont basées sur l’enrichissement en MSC présentes dans les cellules mononucléées de la moelle osseuse par adhérence au plastique suivi de l’expansion ex vivo dans du milieu contenant du sérum sélectionné (Dominici et al, 2006). La durée de l’étape d’expansion ex vivo est très variable et dépend du rapport entre le nombre de MSC dans l’échantillon de moelle osseuse initial et le nombre de MSC nécessaires pour l’injection au patient. Il a été décrit que la capacité des MSC à se greffer dans la moelle osseuse du receveur diminue avec le nombre de passages (Kyriakou et al, 2008). Aucune étude n’a encore montré jusqu’à présent si l’activité pro-hématopoïétique des MSC était modifiée avec la durée de la culture.
Résultats
59 Dans cette étude, les cultures des cellules CD34+ de sang de cordon ombilical ont été effectuées au contact d’une couche nourricière consistant en des MSC récoltées après les passages 2 à 10. Les cellules ont été ensemencées en l’absence de cytokines exogènes. Nos principaux résultats indiquent une diminution progressive de la production de colonies secondaires par les cellules CD34+ cultivées avec des MSC de passages croissants. De même, la génération de cellules myéloïdes CD33+
et CD11b+ différenciées était réduite quand des MSC de passages tardifs étaient utilisées. De plus, le maintien des SRC ex vivo était diminué quand les MSC avaient effectué plus de 5 passages, ce qui représente approximativement 10 à 12 doublements. Par contre, le support des cellules lymphoïdes CD19+ et CD10+ par les MSC n’était pas dépendant du nombre de passages. Quand l’activité de promotion de la prise de greffe par les MSC était étudiée par co-transplantation avec des cellules CD34+ non cultivées, il était observé que les MSC de passages tardifs (> 9 passages ou 25 doublements) étaient moins efficaces que les MSC de passages précoces.
Une caractérisation détaillée des préparations de MSC révélait des variations très faibles au cours des passages. Le phénotype des échantillons de MSC était stable au moins jusqu’au passage 10. La différenciation en graisse, os et cartilage était également conservée. La nature des cytokines, molécules d’adhésion et protéases matricielles détectées dans le milieu conditionné par les MSC était similaire à tous les passages testés. Cependant, les mesures quantitatives des deux molécules les plus abondamment sécrétées par les MSC, IL-6 et IL-8, montraient un déclin progressif de la production d’IL-8 durant la culture tandis que la sécrétion d’IL-6 augmentait. En culture liquide, l’ajout d’IL-8 stimule la prolifération des cellules CD34+ tandis que l’ajout d’un anticorps bloquant le récepteur de l’IL-8 inhibe leur prolifération (Corre et al, 1999). Ceci suggère que la mesure d’IL-8 peut constituer un marqueur reflétant partiellement l’activité pro-hématopoïétique des MSC.
Nos résultats indiquent également l’importance du contact direct entre les MSC et les cellules CD34+ dans les co-cultures. Les cultures de cellules CD34+ séparées des MSC par une membrane semi-perméable ne réduisaient pas la production de colonies secondaires et de SRC en comparaison avec les cultures en contact. Par contre, la production des cellules myéloïdes et lymphoïdes matures était fortement réduite dans les conditions sans contact. Ainsi, le contact direct avec des MSC apparaît être important pour la différenciation des progéniteurs tardifs mais pas pour les premières étapes de l’hématopoïèse. D’un point de vue pratique pour l’utilisation en clinique des co-cultures de cellules CD34+/MSC, les conditions sans contact pourraient permettre l’expansion des cellules en limitant la génération de cellules matures.
Notre étude a également révélé la forte activité pro-lymphopoïétique des MSC. La génération des cellules B in vitro a été précédemment rapportée comme dépendant des lignées cellulaires stromales murines (Fluckiger et al, 1998). Dans notre étude et comme déjà montré récemment par le groupe d’Ichii (Ichii et al, 2008), les MSC sont
Résultats
60 capables de supporter la production de progéniteurs cellulaires B et des cellules B immatures IgM+ dans du milieu contenant du sérum en l’absence de cytokines exogènes. Nous avons étendu ces constatations en montrant, par analyse RT-PCR en temps réel, l’expression des gènes TdT, RAG-1, VpreB, Pax-5 et EBF dans les cellules B cultivées mais pas dans les cellules CD34+ non cultivées. Les cellules B générées dans ce système de co-culture peuvent se différencier jusqu’au stade de cellules B immatures exprimant IgM. Ces cellules pourraient être utilisées pour identifier les signaux extrinsèques impliqués dans le développement des cellules B humaines. L’activité pro-lymphopoïétique des MSC n’est pas affectée par la culture ex vivo prolongée jusqu’à 30 doublements. La génération des cellules B par co-culture de cellules CD34+ et de MSC ouvre la voie à de nouvelles possibilités thérapeutiques. Dans des études cliniques futures, il serait intéressant d’étudier si la co-transplantation de MSC chez les patients subissant une greffe de HSC permet de hâter la régénération des cellules B. L’augmentation de la maturation in vitro des cellules CD34+ en lymphocytes B par les MSC pourrait également avoir des implications dans la conception de procédures d’immunothérapie adoptive (Luo et al, 2009).
En conclusion, notre étude montre que la culture prolongée de MSC de moelle osseuse est associée à une diminution de l’activité supportrice envers les cellules souches repeuplantes et les progéniteurs myéloïdes tandis que le soutien des progéniteurs lymphoïdes B est maintenu. Ces changements ne sont pas accompagnés par des altérations du phénotype ou de la capacité de différenciation des MSC. Une implication importante est la suivante: les procédures de contrôle de qualité actuelles utilisées dans les laboratoires de thérapie cellulaire et basées sur l’analyse du phénotype ne reflètent pas fidèlement les propriétés biologiques des préparations de MSC.
Résultats
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4. Résultats: Deuxième partie: Etude de la régulation de l’activité pro-hématopoïétique des MSC
Pour étudier la régulation de l’activité pro-hématopoïétique des MSC, des anticorps bloquants ou des inhibiteurs des voies de signalisation Notch, Wnt, BMP et HH, de la molécule d’adhésion VCAM-1 et des cytokines IL-6 et IL-8 ont été ajoutés dans les cultures à des concentrations décrites au point 2.10. Les molécules utilisées sont les suivantes:
• la «Cyclopamine KAAD» (Cyclo), qui inhibe spécifiquement la voie de signalisation Hedgehog en se liant au récepteur Smoothened,
• le «γ40 secretase inhibitor II» (Inhib sécrétase), qui bloque la transmission du signal de la voie de signalisation Notch,
• l’ «anti-human jagged 1 antibody» (anti-Jagged 1), qui bloque la voie de signalisation Notch,
• le «Recombinant Human DKK-1» (Dkk), qui inhibe la voie de signalisation Wnt,
• le «Recombinant Human BMPR-IA/Fc chimera» (BMPR), qui lie BMP-4 et empêche l’action de celui-ci,
• le «Monoclonal Anti-human CXCL8/IL-8 Antibody» (anti-IL-8), le «Monoclonal Anti-human IL-6 Antibody» (anti-IL-6) et l’«Anti-Integrin alpha 4 + beta 1 Antibody» (anti-α4), qui empêchent respectivement l’action de l’IL-8, de l’IL-6 et du VLA4 en se liant à ceux-ci.
Comme contrôle, les cellules ont été exposées à un «Mouse IgG1 Isotype Control»
(IgG contrôle) ou à du méthanol (MetOH) ou à du diméthylsulfoxyde (DMSO) respectivement les solvants de la Cyclo et de l’Inhib sécrétase.