2. MATÉRIEL ET MÉTHODES
2.7. Culture à long terme
de 10 % de «Milk Diluent» (KPL, Gaithersburg, Maryland, USA). Trois lavages de 5 minutes ont à nouveau été réalisés, puis la membrane a été incubée dans une solution de TBS-T contenant l’anticorps secondaire IgG de lapin anti-chèvre couplé à la peroxydase (R&D systems) pendant une heure à température ambiante sous agitation.
2.6.2.4. Révélation
Les protéines reconnues par l’anticorps primaire ont été révélées au moyen du kit
«ECL Western Blotting» (GE Healthcare). Un mélange (proportions égales) des réactifs 1 et 2 a été ajouté à la membrane (0,125 ml de mélange/cm²). Le mélange de réactifs contient un substrat de la peroxydase, le luminol. En conditions alcalines, l’enzyme catalyse l’oxydation du luminol qui s’accompagne d’une émission de lumière qui impressionne le film autoradiographique. Après incubation d’une minute, l’excès de réactif a été éliminé et la membrane a été exposée à un film autoradiographique.
2.7. Culture à long terme
2.7.1. Principe
Les cellules stromales sont importantes pour le maintien de l’activité des progéniteurs primitifs. La co-culture avec des cellules stromales est à la base du système dit de culture à long terme (long term culture, LTC). Les cellules stromales utilisées dans les cultures à long terme entraînent une prolifération minimale des cellules hématopoïétiques. Après 5 à 6 semaines de culture, seuls les progéniteurs primitifs sont encore présents dans la culture; les autres progéniteurs plus différenciés ne peuvent survivre aussi longtemps, car ils subissent plus rapidement une différenciation terminale.
Dans un puits d’une plaque 12 puits, 5000 cellules CD34+ de sang de cordon ombilical ont été déposées sur des MSC à confluence récoltées à différents passages dans 1 ml de milieu de culture à long terme (LTC) composé de l’α-MEM supplémenté de 8 % de sérum de cheval, 8 % de sérum de veau fœtal, 0,2 mM de glutamine, 100 U/ml de pénicilline, 100 U/ml de streptomycine (tous de Lonza), 0,1 mM de 2-mercaptoéthanol (Invitrogen) et 0,2 mM inositol (Sigma-Aldrich). Pour les conditions sans contact, les cellules CD34+ ont été séparées des MSC par une membrane perméable avec des pores de 0,4 µm. Les cultures ont été maintenues à 37 °C dans 5 % de CO2 avec un entretien hebdomadaire de la moitié du milieu.
Après 3 semaines, les cultures ont été trypsinisées et lavées pour effectuer les analyses suivantes (Figure 16A).
Matériel et méthodes
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Figure 16: Plan d’expérimentation: culture à long terme. (A) 5000 cellules CD34+ de sang de cordon ombilical ont été déposées sur des MSC à confluence. Pour les conditions sans contact, les cellules CD34+ ont été séparées des MSC par une membrane perméable. Après 3 semaines, les cultures ont été trypsinisées et lavées pour effectuer les analyses suivantes. (B) La persistance des progéniteurs primitifs est mise en évidence en transférant le contenu de la culture à long terme dans un milieu semi-solide. Dans ce milieu, les progéniteurs primitifs persistants vont se différencier et donner naissance à des colonies secondaires. (C) Le contenu de la culture est également récupéré pour effectuer un comptage par cytométrie en flux du nombre de cellules positives pour les antigènes CD34 pour les cellules immatures, CD33 et CD11b pour la lignée myéloïde, CD19 et CD10 pour la lignée lymphoïde.
2.7.2. Enumération des progéniteurs clonogènes en méthycellulose
La persistance des progéniteurs primitifs est mise en évidence en transférant le contenu de la culture à long terme dans un milieu semi-solide. Dans ce milieu, les progéniteurs primitifs persistants vont se différencier et donner naissance à des colonies secondaires.
Un tiers de la culture à long terme a été transféré en duplicata dans un milieu semi-solide consistant en du MethoCult® GF+ H4435 (Stem Cell Technologies).
Après une incubation supplémentaire de 2 semaines à 37 °C, les colonies secondaires ont été comptées (Figure 16B).
2.7.3. Analyse phénotypique des cellules amplifiées 2.7.3.1. Phénotype général
Les cellules restantes ont été récoltées pour une analyse par cytométrie en flux. Les nombres absolus de cellules CD34+, CD10+, CD19+, CD11b+ et CD33+ amplifiées en culture ont été déterminés en utilisant des TruCount tubes (BD Biosciences) contenant un nombre connu de billes (± 50000) (Figure 16C). Pour calculer le nombre exact de cellules, la formule suivante a été utilisée:
Nombre de billes dans le tube
Nombre de billes comptées ൈNombre de cellules comptées ൈ3*
* car un tiers de la culture a été utilisé.
Matériel et méthodes
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Les anticorps suivants ont été utilisés: l’anti-CD34 conjugué à l’APC, l’anti-CD10 conjugué au PE-Cy7, l’anti-CD19 conjugué à l’APC-Cy7, l’anti-CD11b conjugué au PE et l’anti-CD33 conjugué au PerCP-Cy5.5 (tous de BD Biosciences). Les cellules ont été incubées avec les anticorps ou les contrôles IgG pendant 30 minutes à 4 °C dans l’obscurité. Ensuite, les cellules ont été lavées avec du PBS et fixées dans du PBS 1 % formaldéhyde. Les échantillons ont été acquis à l’aide du BD FACSCanto II et analysés avec le logiciel BD FACS DiVa.
2.7.3.2. Phénotype spécifique des cellules B
Le stade de maturation des cellules B générées après 3 semaines de co-culture en contact avec des MSC a été étudié par cytométrie en flux. Les anticorps suivant ont été utilisés: anti-chaînes légères κ conjugué au FITC, anti-chaînes légères λ conjugué au PE, anti-chaînes lourdes µ conjugué au FITC et anti-CD79a conjugué au PE (tous de BD Biosciences). Pour le marquage extracellulaire, les cellules ont été incubées avec les anticorps ou les contrôles IgG pendant 30 minutes à 4 °C dans l’obscurité. Ensuite, les cellules ont été lavées avec du PBS et fixées dans du PBS 1 % formaldéhyde. Pour le marquage intracellulaire, les cellules ont été préalablement fixées et perméabilisées à l’aide du kit BD Cytofix/Cytoperm™
Fixation/Permeabilization (BD Biosciences). Les échantillons ont été acquis à l’aide du BD FACSCanto II et analysés avec le logiciel BD FACS DiVa.
2.7.4. Expression de gènes spécifiques des cellules B
Le stade de maturation des cellules B générées a également été évalué par une analyse RT-qPCR des gènes B spécifiques. L’extraction d’ARN, la transcription inverse ainsi que la PCR en temps réel ont été effectuées comme décrit au point 2.6.1. Les gènes cibles étaient EBF, λ5, Pax-5, RAG-1, TdT et VpreB (cf. Tableau 6 pour les séquences des amorces). Le gène de référence était β2M. La quantité relative des gènes cibles a été calculée en utilisant la méthode des courbes standards recommandée par Applied Biosystems.
Tableau 6: Séquences des amorces oligonucléotidiques utilisées pour l’étude de l’expression de gènes spécifiques des cellules B.
Nom des amorces Séquences
β2M Sens: 5’-GAGTATGCCTGCCGTGTG-3’
Antisens: 5’-AATCCAAATGCGGCATCT-3’
EBF Sens: 5’-GATACGGCTCTGCCGCAAT-3’
Antisens: 5’-CAGCTGAGCCGTTGAGGAA-3’
Pax-5 Sens: 5’-TGGAGGATCCAAACCAAAGG-3’
Antisens: 5’-GGCAAACATGGTGGGATTTT-3’
RAG-1 Sens: 5’-CATCAAGCCAACCTTCGACAT-3’
Antisens: 5’-CAGGACCATGGACTGGATATCTC-3’
TdT Sens: 5’-TTGCCCTGTTGGGATGGA-3’
Antisens: 5’-TCCGCTCATGTGTGGCATAG-3’
VpreB Sens: 5’-GACATCGGTGTGTACAGCGTCTA-3’
Antisens: 5’-TGGCTCTTGTCTGATTGTGAGAA-3’
Matériel et méthodes
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