Les cellules

2. Matériel et méthodes

2.1. Les cellules

2.1.1. Les cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon ombilical (cellules CD34+)

Le sang de cordon ombilical humain a été recueilli stérilement après accouchement.

Tous les échantillons ont été traités dans un délai de 24 heures. Dans les expériences exigeant un grand nombre de cellules, les échantillons ont été mis en commun. Tout le matériel a été acquis avec le consentement éclairé de la mère et utilisé selon les directives établies par le Comité d’Ethique de l’Université de Liège.

2.1.1.1. Séparation des cellules mononucléées sur gradient de densité Les éléments figurés du sang, placés sur un milieu Ficoll de haute densité, subissent durant la centrifugation une migration différentielle qui conduit à leur séparation en deux fractions; d’une part, les érythrocytes et granulocytes (neutrophiles, éosinophiles, basophiles) qui sédimentent au fond du tube et, d’autre part, les lymphocytes, monocytes et plaquettes qui se localisent au niveau de l’interface plasma-Ficoll.

Le sang de cordon ombilical a été récupéré de façon stérile et dilué 2 fois avec du PBS (Phosphate Buffer Saline) 1 % PS (Pénicilline/Streptomycine) (Lonza, Verviers, Belgique). Le mélange a ensuite été déposé délicatement sur le Ficoll^TM paque plus (GE Healthcare, Uppsala, Suède), dans une proportion deux tiers un tiers. Après une centrifugation à 500 g, durant 20 minutes à température ambiante, les cellules mononucléées de l’interface ont été récupérées et centrifugées à 500 g durant 8 minutes à 4 °C. A ce terme, le culot a été lavé avec du PBS 1% PS et centrifugé à nouveau à 500 g durant 8 minutes à 4 °C. Le culot de cellules mononucléées pouvait ainsi être utilisé pour le marquage magnétique.

2.1.1.2. Marquage magnétique des cellules mononucléées

Après récupération de ces cellules mononucléées, les cellules exprimant l’antigène CD34 sont marquées spécifiquement avec un anticorps monoclonal anti-CD34 couplé à un haptène (réactif A2) qui est reconnu par un deuxième anticorps lié à une microbille ferrique (réactif B). L’ajout préalable de FcR Blocking Reagent Human (réactif A1) permet d’éliminer les liaisons aspécifiques en bloquant les récepteurs de la partie constante des immunoglobulines.

Matériel et méthodes

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Le culot a été incubé 30 minutes à 4 °C avec 25 μl de réactif A1 et 25 μl de réactif A2. Au terme de cette incubation, les cellules mononucléées ont été lavées avec 10 ml de PBS 1 % PS avant d’être centrifugées à 500 g durant 8 minutes à 4 °C. Une incubation de 30 minutes a été ensuite réitérée en présence de 25 μl de réactif B. Le culot a ensuite été lavé dans 10 ml de PBS 1 % PS et récolté par une centrifugation de 8 minutes à 500 g, avant d’être remis en suspension dans du PBS 1 % PS.

2.1.1.3. Séparation magnétique des cellules CD34+

La sélection positive des cellules CD34+ est effectuée par MACS (Magnetic Activated Cell Separation CD34+ isolation kits, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Allemagne). Seules les cellules CD34+ marquées par les microbilles ferriques seront retenues dans la colonne chromatographique placée dans un champ magnétique important. Le retrait de l’aimant permet ainsi la récupération de celles-ci.

L’aimant désinfecté a été équipé d’une colonne surmontée d’un pré-filtre qui permet d’éliminer les agrégats cellulaires de l’échantillon marqué. La colonne a été humidifiée à l’aide de 2 ml de PBS 1 % PS. La suspension cellulaire a ensuite été passée dans la colonne et, afin de récolter toutes les cellules mononucléées, le tube a été rincé avec 3 ml de PBS 1 % PS. L’éluat a ensuite été ajouté à la colonne. Le matériel non marqué (fraction négative) est passé au travers de la colonne tandis que les cellules CD34+ magnétiquement marquées (fraction positive) ont été retenues dans celle-ci. Dans le cas où des cellules CD34+ ne se seraient pas accrochées, la fraction négative a été passée une seconde fois dans la colonne.

Après le retrait de celle-ci du champ magnétique, la fraction positive a été expulsée de la colonne à l’aide d’un piston dans 5 ml de PBS 1 % PS. Pour augmenter la pureté des cellules CD34+, la manipulation a été réitérée avec la fraction positive. La fraction positive finale a été comptée sur lame de Fuchs-Rosenthal.

2.1.1.4. Evaluation de la pureté des cellules CD34+

Les suspensions de cellules mononucléées de sang de cordon ombilical contiennent souvent moins d’un pourcent des cellules CD34+; un marquage est donc nécessaire pour évaluer si la pureté désirée est obtenue (> 97 %).

Environ 50000 cellules ont été additionnées de 5 μl d’IgG conjugué au PE (phycoerythrin) ou de 5 μl d’anti-CD34 conjugué au PE (BD Biosciences, Erembodegem, Belgique). Au terme d’une incubation de 30 minutes à 4 °C, les cellules ont été rincées avec 2 ml de PBS 1 % PS. Après avoir été récupéré par une centrifugation à 500 g durant 8 minutes, le culot cellulaire a été suspendu dans 300 μl de PBS 1 % formaldéhyde (Vel, Leuven, Belgique). Les échantillons ont été acquis à l’aide du BD FACSCanto II (BD Biosciences) et analysés avec le logiciel BD FACS DiVa (BD Biosciences).

Matériel et méthodes

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2.1.2. Les cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse ou MSC

Les cellules ont été prélevées de la crête iliaque d’un volontaire adulte sain par ponction médullaire. Tout le matériel a été acquis avec le consentement éclairé du donneur et utilisé selon les directives établies par le Comité d’Ethique de l’Université de Liège.

La récupération des cellules mononucléées de moelle osseuse s’est faite sur base de Ficoll selon le principe précédemment énoncé au point 2.1.1.1. Environ 5 10⁵ cellules/cm² ont été mises en culture dans du MSCGM (mesenchymal stem cell growth medium; Lonza) et incubées à 37 °C sous 5 % de CO2 en atmosphère humide. Après 24 heures, les cellules non adhérentes ont été éliminées et le milieu a été remplacé. Deux fois par semaine, les cultures ont été entretenues jusqu’à l’obtention de 90 % de confluence. A ce terme, les cellules adhérentes ont été détachées avec une solution de trypsine (Lonza) et remises en culture à 5 10³ cellules/cm² durant 10 passages. Vu l’abondance de cellules récoltées après chaque passage, une congélation a été systématiquement effectuée. Les MSC utilisées dans les expériences décrites ci-après ont été isolées de trois donneurs sains différents.

2.1.3. Congélation des cellules

Après récupération des MSC ou des cellules CD34+ par centrifugation à 500 g durant 8 minutes, le culot cellulaire a été suspendu dans 900 μl de sérum de veau fœtal (Lonza). Neuf cents µl de sérum de veau fœtal supplémenté de 20 % de diméthylsulfoxyde (Vel) ont ensuite été ajoutés goutte-à-goutte sur les cellules.

L’entièreté de cette manipulation a été réalisée sur glace. De petites aliquotes de cellules en suspension ont ensuite été placées durant 24 heures à - 80 °C dans une boîte de congélation progressive de 1 °C par minute (5100 Cryo 11c Freezing Container) (Wessington Cryogenics, Tyne and Wear, Angleterre) avant d’être transférées dans l’azote liquide à - 180 °C.

2.1.4. Décongélation des cellules

Après décongélation de l’aliquote de cellules dans un bain-marie préalablement chauffé à 37 °C, la suspension cellulaire a été récupérée de façon stérile et lavée deux fois avec du milieu de culture ajouté goutte-à-goutte afin de ne pas soumettre les cellules à un choc osmotique. A ce terme, les cellules ont été récupérées par centrifugation à 500 g durant 8 minutes et suspendues dans du milieu de culture.

Matériel et méthodes

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