5.1. Introduction
La mise en solution est une étape clé pour la quantification des analytes. La méthode développée doit permettre une dissolution rapide de la chair de poisson et une bonne récupération des éléments cibles, et ce, en utilisant peu de réactifs et d’énergie afin de répondre aux attentes de l’analyse sur le terrain.
Pour ce faire, une méthode de dissolution alcaline à l’aide d’hydroxyde de tétraméthylammonium assistée par ultrasons a été développée. Pour permettre la dissolution efficace des éléments ciblés, plusieurs paramètres devaient être optimisés : 1) le temps, 2) la concentration en TMAH, 3) la température, 4) le ratio de la masse d’échantillon utilisée sur le volume de la solution de TMAH et 5) le fait que la dissolution s’effectue sur de la chair fraîche ou cuite. Effectuer la dissolution sur de la chair cuite implique une phase de chauffage de la chair avant la mise en solution contrairement à la chair fraîche. Pour effectuer une optimisation du système rapidement et efficacement, des plans d’expérience, tels que présentés dans le chapitre 3, ont été réalisés.
Plusieurs sources d’ultrasons peuvent être utilisées. En plus du bain à ultrasons présent dans le laboratoire, un nouveau système a été développé par le département de génie mécanique de l’Université Laval. Ce système est plus puissant et plus facile à transporter. L’optimisation et le développement de la méthode de dissolution de la chair de poisson en quelques minutes seront présentés dans ce chapitre.
5.2. Méthodologie
5.2.1. Réactifs et solutions standards
Toutes les solutions utilisées ont été préparées dans de l’eau ultra-pure provenant d’un système Milli-Q (18,2 MΩ cm @25 °C, 2 ppb TOC) (Millipore, Bedford, MA). Les solutions d’hydroxyde de tétraméthylammonium ont été préparées à partir d’une solution commerciale à 25% en milieu aqueux de Alfa Aesar (Ward Hill, MA, USA). Les échantillons de chair d’omble chevalier utilisés sont des produits d’élevage de la Gaspésie
vendus par la poissonnerie Unimer (Québec, Canada). Les solutions de Pb et de Hg de 1000 mg L-1 proviennent de SCP Sciences (Baie d’Urfé, Canada).Le matériau de référence
certifié utilisé est le IAEA-407, une chair de poisson du lac Michigan lyophilisée. Les expériences ont été réalisées dans des tubes coniques de 15 mL en polypropylène fournis par Sarstedt (Newton, NC, USA). Les échantillons ont été filtrés avec des filtres à seringue 0,2 µm ou 0,45 µm (Sartedt, Nümbrecht, Allemagne), selon les besoins de l’expérience.
5.2.2. Instrumentation
Le bain à ultrasons utilisé est un bainBranson 1510. Les plans factoriels ont été interprétés à l’aide du logiciel JMP (Version 12, SAS Institute Inc, Cary, USA). Les analyses ont été effectuées par ICP-MS/MS (Modèle 8900, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).
5.2.3. Préparation des échantillons
Les échantillons de poisson ont été pesés et enrichis avec 2 mg kg-1 de Pb et de Hg directement dans les tubes coniques de 15 mL. Une solution de TMAH a ensuite été ajoutée avant de placer les échantillons à l’intérieur du bain à ultrasons pour une période de temps prédéfinie. Ils ont ensuite été filtrés et dilués (facteur 50) à l’aide d'HNO3 contenant de
l’Au et un étalon interne (Rh) avant d’être analysés par ICP-MS/MS (Chapitre 5).
5.3. Discussion et résultats
Afin d’obtenir la plus grande récupération possible, plusieurs plans factoriels ont été effectués, en passant de certains ayant des larges plages d’évaluation à d’autres beaucoup plus précis. Le mercure étant un élément complexe à solubiliser et à maintenir en solution, les paramètres du système de dissolution ont d’abord été optimisés pour le plomb.
Tableau 18 :
Paramètres à optimiser pour la dissolution de la chair d’omble chevalier
Paramètres Plage à optimiser
Concentration de TMAH 2 à 25 %
Temps d’ultrasons 5 à 120 min
Température 25 à 80 °C
Masse de chair de poisson pour 5 mL de TMAH 0,1 à 1 g*
Digestion sur chair fraîche ou chauffée
*donnant des ratios masse/volume entre 0,02 et 0,2
Ce premier plan factoriel complètement aléatoire (FFD) a été réalisé en effectuant les analyses en triplicata et en incluant un point central. Il a nécessité 105 expériences, la description de chacune des expériences se retrouve dans le Tableau 19.
Ces valeurs ont été analysées à l’aide du logiciel de plan d’expérience JMP et ont permis de déterminer la valeur p de chacun des paramètres (Figure 32). Dans cette figure, ces derniers sont placés en ordre d’influence sur la réponse du système. Ce qui implique que le paramètre ou l’interaction avec la plus grande influence se trouve en haut du tableau (Figure 32). La valeur Prob> ǀtǀ est équivalente à la valeur p et les lignes bleues représentent des valeur p de 0,05. Ce qui implique que le paramètre ou l’interaction dont la bande de réponses grise dépasse la ligne bleue de valeur p a une influence significative sur la réponse du système, et que plus le paramètre est influent, plus la barre associée sera grande et plus la Prob> |t| sera basse.
Tableau 19 :
Récupération du plomb dans le plan factoriel complet 1
Motif Température
(°C) Temps (min) Ratio m/v [TMAH](%) Chair
Récupération moyenne (n=3) (%) 00001 45 75 0,11 13,5 chauffée 84 ± 56 00002 45 75 0,11 13,5 fraîche 94 ± 23 ++++1 65 120 0,2 25 chauffée 12 ± 5 ++++2 65 120 0,2 25 fraîche 5 ± 2 +++−1 65 120 0,2 2 chauffée ND ++−+1 65 120 0,02 25 chauffée 129,2 ± 0,9 +−++1 65 30 0,2 25 chauffée 60 ± 13 −+++1 25 120 0,2 25 chauffée 27 ± 2 +++−2 65 120 0,2 2 fraîche ND ++−+2 65 120 0,02 25 fraîche 133 ± 71 +−++2 65 30 0,2 25 fraîche 32 ± 12 −+++2 25 120 0,2 25 fraîche 47,67 ±0,02 ++−−1 65 120 0,02 2 chauffée 41 ± 9 +−+−1 65 30 0,2 2 chauffée 1 ± 4 +−−+1 65 30 0,02 25 chauffée 38 ± 8 −++−1 25 120 0,2 2 chauffée ND −+−+1 25 120 0,02 25 chauffée ND −−++1 25 30 0,2 25 chauffée 25 ± 9 ++−−2 65 120 0,02 2 fraîche ND +−+−2 65 30 0,2 2 fraîche ND +−−+2 65 30 0,02 25 fraîche 131 ± 6 −++−2 25 120 0,2 2 fraîche ND −+−+2 25 120 0,02 25 fraîche 69 ± 17 −−++2 25 30 0,2 25 fraîche 42 ± 42 +−−−1 65 30 0,02 2 chauffée 0,52 ± 0,04 −+−−1 25 120 0,02 2 chauffée 12 ± 2 −−+−1 25 30 0,2 2 chauffée 17 ± 12 −−−+1 25 30 0,02 25 chauffée 91 ± 1 +−−−2 65 30 0,02 2 fraîche 1,3 ±0,4 −+−−2 25 120 0,02 2 fraîche 9 ± 1 −−+−2 25 30 0,2 2 fraîche ND −−−+2 25 30 0,02 25 fraîche 86 ± 9 −−−−1 25 30 0,02 2 chauffée 6 ± 1
Figure 32 : Influence des paramètres du FFD 1
Pour faciliter l’optimisation, réduire le nombre d’expériences et le temps nécessaire, les trois paramètres les plus influents ont été optimisés plus précisément, afin obtenir la plus grande récupération de plomb inorganique. Les paramètres seuls ayant obtenu les plus petites valeurs de valeur p ont été réoptimisés soit la concentration, la température et le
temps. Le logiciel d’interprétation des données permet aussi de modéliser la réponse de chacun de ces paramètres à l’intérieur de la plage à l’étude (Figure 33).
Figure 33 : Réponse de l'optimisation du Pb avec le FFD 1, où les graphiques du haut sont la
récupération du Pb et les graphiques du bas représentent la désirabilité en fonction des différents paramètres.
Les profils de réponse présentés indiquent l’influence qu’à un paramètre sur la récupération du Pb. Afin d'augmenter la récupération du Pb, il faut effectuer la dissolution à des températures près de la température ambiante, en moins de 30 minutes, à des concentrations élevées en TMAH. Puisque l’utilisation de chair fraîche ou chauffée et le ratio masse de chair sur volume de TMAH ont peu d’influence sur la récupération (voir Figure 32), ces derniers ont été maintenus constants pour cette seconde série d’optimisation (i.e. 100 mg de chair fraiche pour 5 mL de TMAH). Puisque ce plan d’expérience est très large et que certains des points n’ont pas pu être quantifiés, les tendances obtenues doivent être prises avec précaution et revérifiés avec un plan sur une plage plus restreinte et centrée sur un point optimal. Pour ce faire, les trois paramètres préalablement déterminés comme influents ont été optimisés sur des domaines plus adaptés (Tableau 20, Figure 34 et Figure 35). Tableau 20 : fraîche chair fraîche chauffée Récu p é ra tio n P b
Cette seconde optimisation permet de voir que le paramètre le plus influent est le temps. Ceci est différent de la réponse obtenue avec le premier FFD et s’explique par le fait que le premier plan évaluait de nombreux paramètres simultanément sur une gamme étendue de valeurs, dont certains ne permettaient pas d’obtenir une réponse utilisable lors de la modélisation.
Figure 34 : Influence des paramètres du FFD2
Figure 35 : Réponse de la récupération du Pb avec le FFD2, où les graphiques du haut représentent la récupération du Pb et les graphique du bas représentent la désirabilité en fonction
des différents paramètres.
Ce plan prédit une récupération du Pb de 79% lorsque 100 mg de chair d’Omble chevalier sont mis en solution dans 5 mL de TMAH 10% après 15 minutes d’ultrasons dans un bain à 65°C. Ces conditions ont ensuite été testées en présence de Hg.
Les paramètres influençant la récupération du Hg lors de la dissolution de la chair de poisson dans le TMAH peuvent être différents de ceux qui influencent la récupération du Pb. Pour confirmer l’influence des paramètres et les comparer avec ceux obtenus pour le plomb, un plan factoriel avec la récupération des deux éléments ciblés a été effectué. Les paramètres de ce plan sont encore une fois évalués sur des domaines plus serrés que précédemment (Tableau 21).
Tableau 21 :
Paramètres à optimiser pour maximiser la récupération en Pb et Hg lors de la dissolution assistée par ultrasons
Paramètres Plage à optimiser
Concentration de TMAH 13 à 17%
Temps d’ultrasons 5 à 15 min
Température 55 à 65 °C
Cette optimisation a permis de montrer que le Hg et le Pb ont des comportements différents lors de la dissolution de la chair de poisson dans le TMAH assisté par des ultrasons. En effet, la récupération du mercure augmente avec le temps et la température pour les domaines évalués dans ce plan (Figure 36), alors que le Pb a des paramètres optimaux près du centre du domaine d’optimisation. Trouver un point ou la récupération des deux éléments sera maximale ne semble pas possible; la récupération du Hg sera donc favorisée par rapport à celle du Pb.
Figure 36 : Profil de récupération du Hg (a, c, e) et Pb (b, d, f) lors de la dissolution dans le TMAH en présence d’ultrasons en fonction de (a, b) le temps, la température, (c,d) la concentration et la température, (e, f) la concentration, le temps
(d) (f) (c) (e) (b) (a)
Ces plans ont permis de déterminer que la dissolution de 100 mg de chair fraîche d’omble chevalier dans 5 mL de TMAH 10 % (m/v) en 15 min à 65 °C dans un bain à ultrasons permettent d’obtenir une récupération de (92 ± 6) % pour le Hg inorganique et de (60 ± 15) % pour le Pb. Malheureusement, les deux analytes ayant des comportements différents lors de la dissolution de la chair dans le TMAH assistée par le bain à ultrasons, il est impossible de récupérer l’entièreté d’un analyte sans affecter la récupération du second. Une fois l’optimisation effectuée, nous avons tenté de valider la méthode à l’aide d’un matériau de référence certifié de chair de poisson lyophilisé, le IAEA-407. Malheureusement, ce matériel possède des concentrations en Pb et en Hg sous le mg kg-1 en plus d’être lyophilisé, ce qui a rendu sa dissolution difficile, voire incomplète, ainsi que les concentrations de Pb et de Hg étaient inférieurs au seuil de quantification de notre méthodologie. La méthode a néanmoins été testée avec un matériau de référence certifié frais lors d’un stage à l’Institut des Sciences Analytiques et de Physico-Chimie pour l’Environnement et les Matériaux (IPREM) à Pau en France à l’été 2018. Cette étude a permis de confirmer la récupération du Hg de (91 ± 5) % avec cette méthode (Annexe B).
5.3.2. Nouveau système à ultrasons
La méthode de dissolution de chair de poisson dans le bain à ultrasons fonctionne adéquatement; toutefois cette source d’ultrasons est peu uniforme et le bain se transporte difficilement. De plus, si cette source d’ultrasons devait être utilisée dans des conditions nordiques, un chauffage serait nécessaire pour éviter la formation de glace à l’intérieur du bain. Pour ces raisons, une équipe d’ingénieurs du département de génie mécanique ont fabriqué un système ultrasons (Figure 37) et une interface d’utilisation (Figure 38) spécifiquement pour le projet.
Figure 37 : Système à ultrasons (Vues du dessus et de côté).
Figure 38 : Interface d'utilisation du système à ultrasons
Amplitude d’ultrason s (V) Puissance d’ultrason s (W)
Ce nouveau système, contrairement à l’utilisation du bain à ultrasons, permet l’ajustement de la puissance des ultrasons. Toutefois, puisque la puissance est dépendante de la température du système et que ce dernier se réchauffe lors de son utilisation, la puissance nécessaire varie donc en fonction du temps d’utilisation. Il est plus probant d’évaluer l’énergie fournie à la sonde, soit son amplitude de vibration. Pour éviter que la température de l’échantillon n’excède 65 °C, un ventilateur a été installé pour tempérer cette dernière. Les paramètres optimisés avec le bain à ultrasons ont été testés avec cette nouvelle sonde. Lors de ces expériences, 100 mg de chair d’omble chevalier frais enrichi en Hg et en Pb ont été mis en solution à l’aide d’une solution de TMAH 10 % durant 15 min. Pour favoriser la dissolution, une amplitude maximale de 5 V a été utilisée donnant une puissance variant entre 30 et 60 W. Le Hg et le Pb enrichi sont plus labile que lorsqu’ils sont naturellement présents dans l’échantillon. Cela va tout de même permettre d’évaluer l’efficacité de la méthode, il ne sera toutefois pas possible de la certifier.
Après 5 min d’ultrasons à l’aide de la sonde, il est apparu évident que la dissolution de la chair était complète. Le temps de dissolution a donc été réduit à 5 min. Le Tableau 22 compare les récupérations obtenues avec les différentes sources d’ultrasons (bain et sonde).
Tableau 22 :
Comparaison des différentes sources d'ultrasons sur la récupération Temps (min) Récupération (%) Hg Pb Bain 15 92 ± 6 60 ± 15 Sonde 5 85 ± 2 82 ± 6
La sonde permet une meilleure récupération du Pb que le bain. Toutefois, celle pour le Hg est similaire à celle obtenue à l’aide du bain. Afin d’augmenter les récupérations avec la sonde, la méthodologie utilisant cette dernière a été réoptimisée avec un plan d’expérience à
Tableau 23 :
Paramètres à optimiser pour maximiser la récupération en Pb et Hg lors de la dissolution avec la sonde à ultrasons
Paramètres Plage à optimiser
Concentration de TMAH (%) 5 à 20
Temps d’ultrasons (min) 1 à 5
Amplitude (V) 2 à 5
Figure 39 : Réponse de l'optimisation de la dissolution avec la sonde à ultrasons Les résultats du processus d’optimisation indiquent qu’une dissolution maximale des éléments ciblés est obtenue pour une masse de 100 mg de chair de poisson dans 5 mL d’hydroxyde de tétraméthylammonium à une concentration de 20 % (v/v) en 5 min avec la sonde à ultrasons opérée avec une amplitude de 5 V. Dans ces conditions, une récupération du plomb de (96 ± 9) % et du mercure de (79 ± 5) % serait possible. Pour valider cette modélisation, ces paramètres optimisés ont été utilisés et une analyse sur de nouveaux échantillons (n=5) a été effectuée. Les résultats obtenus montrent plutôt des rendements de dissolution de l’ordre de (96 ± 5) % et (90 ± 4) % pour le Pb et le Hg, respectivement. En plus de permettre une meilleure récupération du Pb et du Hg inorganique, la sonde à ultrasons développée permet une dissolution plus rapide, est plus facilement transportable et permet un meilleur contrôle des ultrasons en permettant l’ajustement de l’amplitude.
Tableau 24 :
Résultats de la dissolution avec la sonde à ultrasons Récupération (%)
Hg Pb
Valeur modélisée (n=3) 79 ± 5 96 ± 9
Valeur obtenue (n=5) 90 ± 4 96 ± 5
Vu l’efficacité de la sonde, des mises en solution dans d’autres solutions ont été envisagées, et des tests qualitatifs ont été effectués dans de l’acide chlorhydrique, de l’acide nitrique (HNO3) et de l’acide formique (HCOOH). L’utilisation d’acide chlorhydrique (HCl) n’a pas
permis d’obtenir une mise en solution adéquate de la matrice de chair de poisson. Toutefois, celles effectuées dans l’acide nitrique (3 M ou concentré) ont permis une dissolution complète de la chair en cinq minutes, mais la précipitation des protéines a néanmoins été observée peu de temps après la fin de la mise en solution. L’utilisation de l’acide formique concentré a permis qualitativement la dissolution de la majorité de la chair de poisson en environ dix minutes. Toutefois, la dissolution à l’aide du TMAH reste la plus efficace.
5.4. Conclusion
En conclusion, une méthode de dissolution de chair de poisson en milieu basique a été développée. Une optimisation à l’aide de plans factoriels complets a permis de mieux comprendre les paramètres affectant le processus de dissolution et éventuellement d’obtenir une récupération de (92 ± 6) % pour le Hg et de (60 ± 15) % pour le Pb en 15 min lorsque 100 mg de chair de poisson frais est mis en solution dans 5 mL de TMAH 10% à 65 °C dans un bain à ultrasons.
Un système à ultrasons portable a également été développé dans le laboratoire du Prof. Bégin- Drolet afin de permettre une utilisation sur le terrain. Cette sonde permet la dissolution de 100 mg de chair de poisson frais en 5 min dans 5 mL de TMAH 20 %. Après filtration (0,45