Le lecteur trouvera ici un descriptif des dispositifs utilisés pour conduire les expériences de ce travail de thèse.
2.2.1 Imagerie sur cellules vivantes Vidéomicroscopie
Les films obtenus pour les expériences au long cours (plusieurs jours) l’ont été grâce à deux vidéomicroscopes équipés de caissons (Life Imaging Services, Bâle, Suisse) permettant une ré-gulation de la température à 37◦C et de l’atmosphère à 5 % de CO2 et 95 % d’humidité relative au-dessus du milieu.
La microscopie en contraste de phase exploite le fait que la lumière voit sa phase changer à la traversée d’un échantillon : les surfaces les plus verticales apparaissent claires alors que les surfaces dans le plan horizontal restent foncées. La microscopie à épifluorescence utilise, comme son nom l’indique, les propriétés fluorescentes de molécules d’intérêt dans l’échantillon. Un jeu de filtres permet de sélectionner la longueur d’onde d’excitation et de ne récupérer sur la caméra que la gamme de longueur d’ondes de la lumière émise. L’objectif utilisé pour mettre au point l’image fluorescente sur le détecteur est le même que celui qui sert à exciter l’échantillon (la séparation des faisceaux se faisant au moyen d’un miroir dichroïque).
Ces deux microscopes sont en outre motorisés, ce qui permet un contrôle de la position de l’échantillon dans le plan horizontal et de sa mise au point. Ce contrôle est effectué durant les expériences par le logiciel MetaMorph (Molecular Devices, Sunnyvale, Californie, États-Unis d’Amérique).
Pour ces deux microscopes, les durées d’exposition typique pour les expériences présentées ici sont de l’ordre de 50 ms pour le contraste de phase, de 150–200 ms pour l’imagerie de GFP, de 300–400 ms pour l’imagerie de mCherry, et 100–300 ms pour l’imagerie de Hoechst. Pour toutes les longueurs d’onde, le gain fixe est pris égal à 0,5×.
Les images sont prises avec des objectifs de grossissement 10×, qui donnent avec les caméras utilisées des champs de vision dont les côtés ont une taille de l’ordre de 1 mm.
Pour les expériences de compétition, les images nécessitant plusieurs champs de vision sont reconstituées à l’aide d’une macro utilisant le module Stitching 2D/3D [163] de Fiji (voir sec-tion 2.3 et annexe D.1).
Expériences de migration antagoniste
Les expériences de cette thèse concernant des monocouches en compétition (voir chapitre 4) ont nécessité d’avoir des conditions géométriques bien définies et reproductibles à l’état initial. Il a été possible de tirer parti de l’expertise de l’équipe dans des dispositifs adaptés à cette contrainte, dérivés de pochoirs en polydiméthylsiloxane (PDMS), très pratiques car permettant d’obtenir une géométrie sur mesure des tissus. Ils ont notamment été très utilisés pour définir les conditions initiales d’expériences de migration ou de cicatrisation [20,21,49,50].
Dans un esprit similaire, il a été fait le choix de recourir à des chambres de culture cellulaire en silicone commerciales (Ibidi Culture-Insert, Ibidi, Planegg, Allemagne). Ces chambres sont constituées de deux puits séparés par une barrière (voir figure 2.1). Cette dernière est dimen-sionnée afin de permettre d’ensemencer des populations différentes sans mélange ni soulèvement de la barrière. Ces chambres permettent de disposer, après leur retrait, de deux populations à
confluence en vis-à-vis séparées par une largeur de 400 µm de substrat libre. Il est ensuite possible d’observer la migration des deux tissus sur cette surface et leur évolution après le contact.
Figure 2.1– Schéma des chambres utilisées pour les expériences de compétition. Le dispositif total a des dimensions extérieures de 9 mm × 9 mm, et chaque puits offre 0,22 cm2de surface de culture.
2.2.2 Imagerie sur cellules fixées Immunofluorescence
En plus des expériences de suivi temporel de nos populations, nous avons également mené des expériences de marquages fluorescents de nos populations de cellules HBEC afin de localiser et de contrôler le niveau d’expression de protéines d’intérêt. Ces expériences, à la différence de celles de vidéomicroscopie, sont destructives.
Les échantillons utilisés sont des lames de verre ensemencées de la même manière que les puits de culture utilisés en vidéomicroscopie. Ces échantillons sont ensuite fixés à différents instants choisis à l’aide de paraformaldéhyde. Toutes les réactions biochimiques ayant été arrêtées net, on marque ensuite les protéines telles qu’elles se présentaient au moment de la fixation.
Le détail du protocole utilisé pour ces expériences d’immunofluorescence est disponible dans l’annexe B.5.
Dans cette étude, plusieurs marquages immunofluorescents ou menés à l’aide de l’utilisation de toxines ont été réalisés afin d’étudier l’évolution des jonctions cellule-cellule et des adhésions cellule-substrat dans les monocouches de HBEC (voir section 3.3.3) :
— La E-cadhérine a été marquée directement au moyen d’un anticorps anti-E-cadhérine pro-duit dans le lapin et conjugué au fluorophore Alexa Fluor 488 (Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, États-Unis d’Amérique) à dilution 1:800 pendant 1 h.
— La vinculine a été marquée indirectement, en utilisant un anticorps primaire anti-vinculine produit dans la souris (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri, États-Unis d’Amérique) à dilution 1:400 pendant 1 h ; puis un anticorps secondaire immunoglobuline de type G (IgG) anti-souris conjugué au fluorophore Alexa Fluor 546 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, États-Unis d’Amérique) à dilution 1:500 pendant 1 h.
— Les filaments d’actine ont été marqués avec de la phalloïdine conjuguée au marqueur Alexa Fluor 488 (Molecular Probes) à dilution 1:1000, pendant la seconde étape du marquage de la vinculine.
Figure 2.2 – Image de contrôle obtenue sur un îlot de cellules MDCK pour un marquage de la vinculine (en rouge), des filaments d’actine (en vert) et des noyaux (en bleu). Barre d’échelle : 20 µm.
Marquage des noyaux
Pour obtenir un marquage spécifique des noyaux, on utilise préférentiellement des agents fluorescents d’intercalation dans l’ADN (communément appelés « intercalants »). Ces molécules, comme leur nom l’indique, ont pour spécificité de pouvoir venir s’intercaler entre deux paires de bases dans l’ADN. Étant fluorescentes, elles permettent ensuite de visualiser la localisation du noyau.
Les noyaux des cellules fixées ont été imagés à l’aide de DAPI, molécule pouvant se lier fortement aux bases adénine (A) et thymine (T) de l’ADN, et présente dans le milieu de montage utilisé dans les expériences d’immunofluorescence.
Ponctuellement, ce marquage a également été effectué avant fixation, à l’aide du colorant Hoechst 33342, utilisé dans sa formulation NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Molecular Probes). Quelques gouttes de cette solution ajoutées dans le milieu permettent de marquer, après incubation pendant 20 minutes, le noyau de cellules encore vivantes. Cet intercalant, très toxique pour les cellules, permet de les observer pendant quelques heures. Ces noyaux sont imagés à l’aide des microscopes également utilisés pour la vidéomicroscopie.
Imagerie
Les expériences d’immunofluorescence ont été imagées avec un microscope confocal, pour obtenir des piles de tranches optiques fines et ainsi reconstruire une image tridimensionnelle du signal d’immunofluorescence. Nous avons utilisé un tel microscope droit avec un objectif de grossissement 63× à immersion dans l’huile. Ce microscope fait partie de la Plate-forme Imagerie Cellulaire et Tissulaire (PICT-IBiSA) de l’Institut Curie.
Un microscope de fluorescence par réflexion totale interne (TIRF) a été utilisé pour imager des vinculines, protéines localisées sur un plan très proche de la surface. Nous avons utilisé un microscope TIRF inversé muni d’un objectif 100× à immersion dans l’huile. Ce microscope est disponible au sein de la plate-forme Nikon Imaging Center de l’Institut Curie.
Ces deux microscopes sont également contrôlés en position et en mise au point à l’aide du logiciel MetaMorph.