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5.4.4.1Spécificité du marquage

Le marquage de la SRB est donc bien spécifique des fibres élastiques ; cette affirmation a été vérifiée à la fois par des observations morphologiques et par des méthodes immunohistochimiques. Une question reste cependant en suspens. Nous avons toujours qualifié ce marquage comme étant un marquage des fibres élastiques. Or, comme nous avons pu le voir précédemment, les fibres élastiques sont composées d’élastine et de microfibrilles. A l’heure actuelle, nous ne pouvons pas encore préciser sur laquelle de ces structures se fixe la SRB. Des expériences sur des souris KO elastine -/- sont en cours de développement. Ces souris génétiquement modifiées ne peuvent pas produire d’élastine. Si la SRB se fixe spécifiquement sur l’élastine, aucun marquage ne devrait être visible. L’inconvénient majeur

de ce type d’expérience réside dans le fait que les souris elastine -/- ne survivent guère plus de trois jours après la naissance. L’abord chirurgical est donc en train d’être défini. De même, une expérience similaire est également envisagée sur des souris KO pour les microfibrilles (en collaboration avec Gilles Faury, Laboratoire de Physiopathologie Vasculaire – Grenoble). Cependant, si l’on considère que l’élastine est une protéine hydrophobe et que la SRB est une molécule hydrophile, une interaction entre les deux parait moins probable.

La SRB est donc une molécule particulièrement intéressante aux nombreuses propriétés. Nous avons pu mettre en évidence dans ce travail de thèse une spécificité pour les fibres élastiques ainsi que pour les astrocytes. Cette double spécificité ne pose guère de problème en pratique car les tissus cérébraux ne contiennent pas de fibres élastiques (hormis dans la paroi des grosses artères). Inversement, les tissus périphériques ne contiennent pas d’astrocytes.

5.4.4.2Avantages de la SRB

Comme nous avons pu le voir précédemment, la SRB est une molécule hydrophile qui peut être injectée en grandes quantités chez l’animal sans générer de dommages. La DL50 est très élevée (10300 mg/kg). La SRB appartient également à la famille des xanthenes dont de nombreux membres sont déjà utilisés en intravital comme la rhodamine 6G ou la Sulforhodamine 101173; 174; 108; 158.

Son spectre d’émission permet également l’utilisation simultanée d’autres colorants comme le FITC ou le Hoechst ; certaines protéines fluorescentes comme la GFP ou encore l’imagerie par SHG.

Les deux méthodes d’application (intraveineuse ou dépôt local) sont d’une grande simplicité pour le manipulateur et ne requièrent pas de longs temps d’incubation ou d’autres traitements chimiques des tissus.

Enfin, le rendement quantique élevé de la SRB (80%)175-177

et son émission dans le rouge permettent de s’affranchir des phénomènes de diffusion et d’absorption fréquemment rencontrés aux longueurs d’ondes plus basses. Il est alors possible d’imager les artères in vivo jusqu’à des profondeurs de 250µm. De manière générale, quand on réalise une acquisition simultanée SRB/SHG, le signal SHG est perdu bien avant celui de la SRB. De même, la puissance laser d’excitation est bien souvent relevée pour avoir un signal SHG correct ; la voie SRB doit alors avoir un gain diminué lors de l’acquisition.

5.4.4.3Comparaison avec l’endofluorescence

De nombreuses publications ont rapporté l’utilisation des propriétés d’endofluorescence de l’élastine pour observer les fibres élastiques en microscopie biphotonique.

Différentes longueurs d’ondes d’excitation ont été décrites : 760178-180

, 800123

et 860nm119; 181 . Devant la diversité des systèmes (type d’objectif, ouverture numérique, …) et des paramêtres utilisés, il est assez difficile d’effectuer des comparaisons quantitatives entre ces études et la nôtre. Cependant, dans chacun des cas, l’émission d’endofluorescence est moins forte en comparaison de ce qui est obtenu avec le marquage par la SRB. De même, l’émission a lieu dans la gamme spectrale du bleu123 (aux alentours de 500nm) ce qui augmente les phénomènes de diffusion et d’absorption. Ces phénomènes déjà présents sur des anneaux d’artères isolés peuvent se révéler beaucoup plus importants pour une observation en intravital.

Les temps d’exposition (ou le nombre d’images à intégrer pour obtenir une image finale avec un bon contraste) sont donc assez élevés. Certaines publications décrivent une durée de 5s par image pour une excitation à 860nm119. De tels délais sont incompatibles avec une observation en intravital ; de même les faibles profondeurs d’observations décrites en endofluorescence (50µm) ne permettent pas d’imager une artère telle que l’artère saphène dans son intégralité. L’élastine n’est pas la seule biomolécule à présenter des propriétés d’endofluorescence lorsqu’elle est excitée à deux-photons. D’autres biomolécules comme les flavines ou le NAD(P)H ont un comportement similaire182. Il est alors difficile de réaliser une segmentation efficace entre la fluorescence émise par l’élastine et celle des autres molécules. Cependant, une longueur d’onde d’excitation de 860nm semblerait favoriser l’excitation de l’élastine de façon majoritaire119; 181

.

Notre méthode de coloration à la SRB apparaît donc comme apportant un signal plus important à des puissances laser comparables à celles utilisées en endofluorescence. Une image peut être acquise dans des délais beaucoup plus courts (inférieur à une seconde). A titre de comparaison une imagerie d’endofluorescence réalisée dans les mêmes conditions qu’une imagerie SRB ne donne pas de signal détectable pour l’élastine (Figures 5.10).

Ce marquage est également plus spécifique, sans parasitage par des signaux d’autres molécules, car recueilli à des longueurs d’ondes élevées où peu de biomolécules présentent une endofluorescence.

Enfin, il permet de travailler aussi bien sur des anneaux d’artères, que sur des explants, des biopsies ou directement sur l’animal entier en intravital.