Le microscope utilisé lors de nos études est installé au Laboratoire de Spectrométrie Physique sur le campus universitaire de Grenoble. Il s’agit d’un modèle construit à partir de plusieurs éléments séparés permettant de faire évoluer l’installation et de réaliser des modifications en fonction des expériences à réaliser. Les éléments principaux sont un microscope Olympus BX50WI, une tête confocale Biorad MRC 1024, deux PMTs externes ajoutés et un laser femtoseconde Titane-Saphir (Tsunami, Spectra-Physics). Nous allons revenir sur ces différents éléments. Une représentation schématique de l’installation de microscopie biphotonique a été présentée dans la figure 4.18.
La figure 5.1 ci après présente quelques photographies de la plateforme de microscopie biphotonique localisée au Laboratoire de Spectrométrie Physique.
Figure 5.1 : Plateforme de microscopie biphotonique utilisée lors de ce travail de thèse. L’ensemble des appareillages est installé sur une table optique d’approximativement 3.5m de long sur 1.20m de large. La longueur d’onde d’émission ainsi que le mode pulsé du laser peuvent être vérifiés en permanence sur deux oscilloscopes (images au centre). La platine du microscope est motorisée et équipée d’un poste d’anesthésie gazeuse avec un système d’aspiration de l’air (photo du bas – tuyau bleu). L’acquisition est contrôlée par deux ordinateurs installés à proximité (hors champ).
5.1.1 Laser d’excitation.
L’excitation est fournie par un laser Titane-Saphir (Tsunami, Spectra-Physics) pouvant délivrer des impulsions femtosecondes en mode bloqué dans une gamme de longueurs d’ondes allant de 760 à 850nm. Les impulsions ont une durée de 120 fs et une fréquence de 82MHz2.
Il est pompé à 532nm avec une puissance de 4.2W par un laser continu Nd : YVO4 doublé en fréquence. Ce laser est lui-même pompé par des diodes laser couplées par fibres optiques. La puissance moyenne en sortie du laser femtoseconde se situe aux alentours de 600mW (ce qui correspond à des puissances de crête de 60kW). Cependant, une forte déperdition de la puissance a lieu lors du trajet optique. La puissance délivrée à l’échantillon en sortie d’objectif a été mesurée à l’aide d’un puissancemètre calorimétrique (Coherent Inc. – modèle 205). Pour une puissance moyenne de 600mW en sortie de laser, la puissance en sortie d’objectif est de 150mW.
5.1.2 Modulation de la puissance laser
Lors de l’étude d’échantillons biologiques en intravital ou sur des explants, la puissance du faisceau laser envoyée sur l’échantillon doit pouvoir être ajustée afin de ne pas créer de dommages ou d’induire un photoblanchiment des colorants. Cette régulation peut être réalisée par deux moyens :
- via des filtres de densité optique différente installés sur un disque commandé par l’interface constructeur livrée par Biorad. L’atténuation de la puissance est cependant limitée à 100, 30, 10, 3 ou 0.3%. Ce système n’est pas adapté à l’étude intravitale qui nécessite de pouvoir moduler la puissance de transmission du laser entre 30 et 100%. - en jouant sur la polarisation de la lumière. En sortie du laser, la polarisation de la
lumière est verticale. Un dispositif constitué d’une lame λ/2 sur un moteur rotatif placé devant deux polariseurs disposés à l’angle de Brewster permet de réguler l’intensité du faisceau. Les mouvements du moteur sont gérés par une interface indépendante du système Biorad programmée en Delphi. Il est alors possible de régler l’intensité du laser par pas de 10%. Ce système a été conçu au laboratoire (Pascale Vérant et Jean-Claude Vial).
Figure 5.2 : Caractéristiques des différents coins de cube utilisés au cours des différentes expérimentations présentées dans ce travail de thèse. Les traits horizontaux pleins représentent les longueurs d’ondes coupées par les différents filtres. Les traits verticaux en pointillés représentent les valeurs de transition des différents miroirs dichroïques.
5.1.3 Caractéristiques des objectifs
La quasi-totalité des travaux effectués en microscopie biphotonique présentés dans cette thèse ont été réalisés avec un objectif 20X, 0.95NA, Xlum Plan FI Olympus conçu pour l’infrarouge et l’immersion dans des milieux aqueux. Sa distance de travail est de 2mm. La résolution latérale a été mesurée à 1,2µm (à l’aide d’une lame) et la résolution axiale (en z) a été estimée à 3,5µm2.
Les études sur cultures cellulaires ont été réalisées avec un objectif 60x (Olympus LUM Plan FI / IR ; NA=0.90) et les études sur fenêtres dorsales avec un objectif 10x (Olympus UM Plan FI ; NA=0.30).
5.1.4 Acquisition du signal
La fluorescence émise est récupérée en épicollection puis dirigée sur un coin de cube à l’aide d’un miroir dichroïque transmettant le faisceau laser d’excitation et réfléchissant les longueurs d’ondes de fluorescence (coupure à 665nm). Trois coins de cubes différents ont été utilisés au cours de ce travail. Leurs différentes caractéristiques sont reprises dans la figure 5.2. Il est également important de noter qu’une 4eme configuration (Rhodamine/SHG) existe en rajoutant un filtre supplémentaire (590HP) à la configuration Visible/SHG.
Par la suite nous nous référerons aux appellations suivantes pour indiquer la configuration utilisée :
- Rhodamine/FITC : HQ535/30, 585DCXR, HQ620/60. - Visible/SHG : 405/40, 440DCXR.
- Rhodamine/SHG : 405/40, 440DCXR, 590HP.
- Rhodamine/Hoechst : HQ480/60, 515DCLP, HQ630/60.
Des filtres sont également en sortie du coin de cube afin de couper la réflexion du laser. Ces filtres passe-bas sont soit un 710ASP, soit un BG39.
Les photons sont ensuite collectés sur des PMTs externes dont l’amplification (gain) et l’offset sont réglés par des potentiomètres localisés sur un boîtier externe. L’offset est réglé de façon à ce que le nombre de photons détectés soit proche de zéro lorsque le laser est coupé.
L’échantillonnage est réglé de façon à avoir des images de 512x512 pixels. Il est cependant possible de zoomer en utilisant l’interface Biorad. La taille des images obtenues en fonction du zoom est donnée dans le tableau 5.1.
La durée d’acquisition d’une image est de l’ordre de 0.9s. Les images sont codées en 8bits par l’interface Biorad (convertisseur analogique/numérique) ; cependant l’acquisition est également possible en 12bits via un interfaçage récemment développé. L’intégralité des images présentées ici ont été réalisées en 8bits (256 niveaux de gris).
Zoom Echelle de l’image obtenue
1x 598 x 598 µm2 1.5x 398.6 x 398.6 µm2 2x 299 x 299 µm2 3x 199 x 199 µm2 4x 149.5 x 149.5 µm2 5x 119.6 x 119.6 µm2
Table 5.1 : Taille des images obtenues en fonction du zoom sélectionné sur l’interface Biorad et avec l’objectif 20x.
5.1.5 Interface informatique
La figure 5.3 détaille les différentes fonctionnalités de l’interface Biorad. L’affichage des images obtenues à partir des photons captés par les deux PMTs est présentée en temps réel. Une addition des deux voies « merge » est également proposée afin d’avoir une première idée de la colocalisation de certains signaux. Le réglage de la puissance du laser (avec ou sans déclenchement, c'est-à-dire changement de puissance entre chaque image et non en cours d’acquisition) ainsi que certains traitements d’images par le logiciel ImageJ (v.1.36b) sont réalisés sur un second ordinateur en interface avec le logiciel Biorad.