Chapitre 2 : Résultats supplémentaires
3. Discussion
Les différents adjuvants utilisés en chimiothérapie ont, en grande partie, un effet sur les cellules cancéreuses, mais peuvent provoquer de nombreux effets secondaires et même favoriser la résistance au traitement. De ces adjuvants, on retrouve le cisplatine. Ce produit a la capacité de tuer les cellules cancéreuses en endommageant l’ADN, en inhibant la mitose et la synthèse de l’ADN et en provoquant le mort cellulaire.[34]
Plusieurs analogues de cisplatine ont d’ailleurs été à l’étude afin de trouver un autre moyen de contrer cette résistance tout en conservant un bon effet thérapeutique.[34] Parmi ces études,
Figure 24 . L’anéthol potentialise l’effet du cisplatine des cellules cancéreuses buccales. A) La
prolifération cellulaire a été évaluée par le test MTT. Les cellules ont été exposées à différentes concentrations de cisplatine avec ou sans anéthol 10 mM. Les résultats ont été rapportés avec les moyennes (% prolifération) ± écart-type (n = 5) et le contrôle représente 100 % de prolifération. Une différence significative a été observée avec l’ajout de 20 mM de cisplatine seul. L’ajout de 10 mM d’anéthol à 50 mM diminue à 76,5 % la prolifération des cellules cancéreuses. B) La cytotoxicité a été évaluée par dosage de la LDH par l’utilisation de surnageant. Les résultats ont été rapportés avec les moyennes (% cytotoxicité) ± écart-type (n = 3) par rapport au contrôle. Les résultats sont considérés comme significatifs lorsque * p < 0,05 ou ** p < 0,005.
le carboplatine a montré un potentiel fort intéressant dans les essais cliniques, le rendant disponible pour le traitement des cancers des ovaires, des poumons, de la tête et du cou. En plus de différer au niveau structural, le carboplatine possède une durée de vie plus longue et un effet moins puissant que le cisplatine. Bien qu’il diminue légèrement les effets secondaires, ce dernier cause un effet myélosuppresseur majeur.[34]
La médecine traditionnelle pourrait toutefois être une alternative intéressante pour contrer les effets secondaires et la résistance au cisplatine. Les résultats supplémentaires permettent la mise en évidence des propriétés bénéfiques de l’anéthol in vitro sur les cellules Ca9-22 provenant d’un carcinome épidermoïde gingival. Il semblerait que l’anéthol agit de manière synergique avec le cisplatine, un des principaux agents utilisés en chimiothérapie. Cet effet de synergie entre l’anéthol et le cisplatine a été mis en évidence par les résultats obtenus des tests MTT et de dosage de la LDH. Nos résultats sur l’interaction du cisplatine et de l’anéthol sont des pistes de recherche très pertinentes. Toutefois, des études supplémentaires devront être réalisées pour mieux comprendre les mécanismes et déterminer les meilleures doses à combiner pour réduire les effets secondaires de cisplatine lors des traitements de chimiothérapie. Les effets de cette synergie sur l’apoptose, le stress oxydatif, l’autophagie et le dommage à l’ADN chez les cellules du cancer buccal et sur d’autres types cellulaires dont ceux de la langue seront donc pertinents à étudier.
Conclusion et perspectives
Le but de ce projet de maîtrise était d’étudier les mécanismes d’actions de l’anéthol (1- methoxy-4-[(E)-prop-1-enyl] benzène) dans un modèle de cellules de carcinome buccal (Ca9-22) afin d’explorer le potentiel de son utilisation comme agent alternatif ou complémentaire de traitement du cancer buccal. Les traitements conventionnels actuellement utilisés contre le cancer de la bouche, bien qu’efficaces, causent de nombreux effets secondaires et diminuent la qualité de vie des patients. Ainsi, le traitement au cisplatine à une dose inférieure au traitement actuel, combiné à un traitement à base de plante tel que l’anéthol, pourrait augmenter les bénéfices thérapeutiques en plus d’améliorer l’espérance de vie des patients. L’hypothèse formulée au début de ce projet proposait l’existence d’effets destructeurs préférentiels de l’anéthol sur les cellules cancéreuses buccales par le biais des voies de signalisation impliquées dans la prolifération cellulaire et l’apoptose. Par ses propriétés antitumorales[58], anti-inflammatoires[80] et antioxydantes[95], l’anéthol pourrait
diminuer la résistance à la chimiothérapie en plus de réduire la toxicité non spécifique envers les cellules saines. De plus, nous suggérons que, l’anéthol possède un effet potentiel inhibiteur prométastatique des cellules cancéreuses buccales en ciblant les voies de l’EGFR et d’autres voies de signalisation liées au cancer : MAPKases, Wnt et NF-κB.
Le premier objectif de cette étude était d’évaluer l’effet de l’anéthol sur la viabilité cellulaire. Les résultats de morphologie, de compte cellulaire et de MTT ont montré que l’anéthol induit une inhibition dose-dépendante de la prolifération des cellules Ca9-22. À une concentration de 8 µM, l’anéthol a la capacité d’inhiber 50 % de la prolifération in vitro des cellules cancéreuses sans avoir un impact significatif sur les cellules épithéliales et les fibroblastes provenant d’un tissu sain. Les résultats de LDH vont également dans ce sens, suggérant que l’anéthol induit une cytotoxicité dose-dépendante et sélective sur les cellules cancéreuses buccales. Les résultats de l’étude effectuée par Chen et deGraffenried[58], sur les
cellules MCF-7 et MDA-MB-231 provenant d’un cancer du sein abondent dans ce sens, suggérant que l’anéthol inhibe la prolifération des cellules cancéreuses après l’ajout d’une concentration d’anéthol allant de 10-6 à 10-3 M.
Le deuxième objectif visait à vérifier l’effet de l’anéthol sur la modulation des protéines régulatrices du cycle cellulaire des cellules cancéreuses. Celles-ci ont la capacité de déréguler les protéines clés afin de suractiver le cycle cellulaire et de favoriser une croissance cellulaire anormale. Pour parvenir à cet objectif, trois protéines importantes ont été sélectionnées, soit la cycline D1, p21 et p53. Les résultats d’immunobuvardage ont montré que l’expression protéique de la cycline D1, qui joue un rôle primordial dans le déclenchement du cycle cellulaire en phase G1, était diminuée en présence de 10 µM d’anéthol. L’anéthol avait également pour effet d’augmenter l’expression de p53, un gène suppresseur de tumeur, et de p21, un inhibiteur de cycline. Ainsi, les résultats présentés suggèrent que l’anéthol a la capacité d’inhiber le cycle cellulaire des cellules cancéreuses. Elkady[61] a également montré
une similitude au niveau des résultats d’immunobuvardage lorsque les cellules cancéreuses PC-3 provenant d’un cancer de la prostate étaient stimulées par des concentrations d’anéthol. Une diminution de l’expression de la cycline D1 et une augmentation de p21 et p53 ont été notées.[61] Chen et deGraffenried[58] ont également montré
dans leur publication que l’anéthol avait la capacité d’accroître l’expression du gène suppresseur de tumeur p53 dans les cellules cancéreuses du cancer du sein.
Le troisième objectif consistait à observer l’effet de l’anéthol sur l’induction de l’apoptose des cellules Ca9-22. Les cellules cancéreuses ont la capacité d’inactiver les processus de mort cellulaire pour favoriser la prolifération. Ainsi, les résultats de cytométrie en flux par le marqueur d’iodure de propidium et d’annexine V ont montré que l’anéthol induit de manière dose-dépendante la mort cellulaire des cellules cancéreuses après 24 et 48 h. Elkady[61] a
également montré une augmentation du marqueur annexine V lorsque les cellules provenant d’un cancer de la prostate ont été exposées à 100 et 250 µM d’anéthol.
Le quatrième objectif était d’étudier la modulation des protéines pro et antiapoptotiques des cellules cancéreuses buccales après 24 h d’exposition à 10 µM d’anéthol. Les gels d’électrophorèse ont permis de montrer une augmentation de l’expression de Bax, une protéine proapoptotique, et une diminution de Bcl-2, une protéine anti-apoptotique. La voie des caspases 3 et 9 a également été mise à l’étude pour mieux comprendre l’effet de l’anéthol sur les voies de signalisation apoptotique. Les résultats démontrent le clivage de la caspase 3
et 9 indiquant l’activation de la voie apoptotique intrinsèque. De plus, l’expression du cytochrome C, un acteur important de la voie intrinsèque de l’apoptose, était augmentée en présence d’anéthol. Finalement, le clivage de PARP1, une protéine importante dans la réparation de l’ADN, la stabilité génomique et la mort cellulaire programmée, indique l’activation de cette voie et l’effet bénéfique de l’anéthol sur l’induction de la mort cellulaire des cellules cancéreuses buccales. Les études de Chen et deGraffenried[58], Elkady[61] et
Ghasemian et coll.[59] ont aussi montré l’effet de l’anéthol sur les molécules ayant un rôle
important dans la mort cellulaire, dont Bcl-2, Bax, les capsases et PAPR1, sur d’autres types de cellules cancéreuses. Leurs résultats suggèrent que l’anéthol module positivement les molécules proapoptotiques et inversement inhibe les molécules anti-apoptotiques.
Le cinquième objectif avait pour but d’évaluer l’effet de l’anéthol sur la migration cellulaire et la transition épithélio-mésenchymateuse des cellules cancéreuses buccales. Une des caractéristiques des carcinomes est leur capacité à migrer vers un site adjacent pour former des métastases rendant les cancers plus agressifs. Les résultats du test de lésion cellulaire ont exposé que l’anéthol a la capacité d’inhiber la migration des cellules cancéreuses contrairement à la condition sans anéthol. De plus, l’expression protéique par immunobuvardage a montré une augmentation d’E-cadhérine, un marqueur épithélial, et une diminution de vimentine, un marqueur du mésoderme, suggérant une inhibition de la transition épithélio-mésenchymateuse et de l’invasion. Les résultats présentés par Ha et coll.[63] étudiant l’effet antimétastasique des cellules DU145 provenant d’un cancer de la
prostate suggèrent que l’anéthol a la capacité d’inhiber la migration cellulaire, diminuer l’expression de vimentine et inversement d’augmenter l’expression d’E-cadhérine. En plus de réaliser ce cinquième objectif, nous avons évalué l’effet de l’anéthol sur les métalloprotéases et leurs inhibiteurs pour mieux comprendre le rôle de l’anéthol dans la migration. Nos résultats ont montré que l’anéthol à 3 et 30 µM inhibe significativement les MMPs (1, 2, 3, 7, 8, 9, 10, 12 et 13), et inversement augmente l’activité des TIMPs (1 à 4). L’anéthol aurait la capacité d’inhiber la dégradation de la matrice extracellulaire et donc, de favoriser une inhibition de la migration des cellules Ca9-22. Les études présentées par Andrulewicz-Botulińska et coll.[49], Choo et coll.[64], Ha et coll.[63] et Rhee et coll.[62] montrent
Le sixième objectif consistait à étudier l’effet de l’anéthol sur la modulation des protéines des voies de signalisation de l’EGFR et d’autres voies de signalisation liées au cancer, plus particulièrement les voies MAPKinase, NF-kB et Wnt des cellules Ca9-22. Les mécanismes cancéreux ont la capacité de suractiver ces voies de signalisation. La voie des MAPKinase, comprenant entre autres ERK1/2, JNK et p38, joue un rôle primordial dans la prolifération, la différenciation et la survie. La voie de NF-kB joue en plus un rôle dans l’inflammation. Alors que la voie de Wnt est essentielle dans l’adhésion cellulaire. Les résultats d’immunobuvardage ont montré une diminution significative de l’expression de la forme phosphorylée de ces trois voies suggérant que l’anéthol a la capacité de moduler à la baisse leur activité. Une étude publiée par Aggarwal et Shishodia[188] suggère également que
l’anéthol cible les voies des MAPKiases et NF-kB. De plus, les résultats de Choo et coll.[64]
sur des cellules tumorales de fibrosarcome humain HT-1080 ont montré une inhibition des voies de signalisation impliquant Akt, ERK, p38 et NF-kB en présence d’anéthol (Figure 25). En plus des objectifs énoncés dans ce projet de maîtrise, des expériences additionnelles ont été effectuées en étudiant le rôle de l’anéthol sur l’autophagie, le stress oxydatif et son interaction avec le cisplatine sur la viabilité cellulaire. Les résultats ont montré que l’anéthol a la capacité d’induire l’autophagie, un autre processus contrôlé de mort cellulaire, chez les cellules Ca9-22. La capacité de diminuer l’autophagie pourrait également aider à contrer la chimiothérapie. Les résultats de cytométrie en flux ont également montré que l’anéthol peut diminuer l’activité des ROS et augmenter l’activité du GSH réduisant ainsi les conditions favorables au développement cancéreux. D’ailleurs, Elkady[61] et Rhee et coll.[95] ont montré
dans leur publication que l’anéthol avait la capacité de réguler l’activité des ROS. De plus, les résultats présentés dans le chapitre 4 suggèrent que l’anéthol 10 µM potentialise l’effet du cisplatine suggérant son interaction positive contre les cellules cancéreuses buccales. Ainsi, il sera pertinent d’élaborer les mécanismes cellulaires par lesquels l’anéthol agit sur l’autophagie et le stress oxydatif en plus de son interaction avec le cisplatine afin de comprendre davantage le fonctionnement de ce composé aromatique.
Figure 25 . Schéma synthèse illustrant les différents effets de l’anéthol in vitro sur des cellules gingivales cancéreuses (Ca9-22). L’anéthol diminue la prolifération des cellules en diminuant l’expression de la cycline
D1 et en augmentant l’expression de p53 et p21. L’anéthol induit la mort cellulaire des cellules cancéreuses en favorisant la voie de l’apoptose par une activation de Bax et une diminution de Bcl-2. L’anéthol augmente également l’expression du cytochrome C et favorise l’activation des caspases et PARP1. L’anéthol favorise l’autophagie en augmentant l’expression de LC3B et p62. L’anéthol diminue le stress oxydatif dans l’environnement en inhibant l’activité des ROS et en favorisant la GSH. L’anéthol augmente l’activité de la E- cadhérine et des TIMPs et inversement diminue l’activité de vimentine et des MMPs suggérant une inhibition la migration et l’invasion. Finalement, l’anéthol inhibe les voies de signalisation de l’EGRF (MAPKinase et NF-kB) ainsi que la voie de Wnt. (© par Camille Contant, 2020)
Finalement, après avoir atteint ces objectifs en plus d’avoir eu des résultats supplémentaires prometteurs, il serait intéressant de mettre au point un modèle tridimensionnel de culture cellulaire pour observer l’effet de l’anéthol sur l’ensemble de la muqueuse buccale. Nos résultats in vitro ont montré que l’anéthol était sélectif dans un environnement où les types cellulaires étaient séparés. Il sera donc important d’introduire les cellules Ca9-22 dans un modèle contenant des cellules de la muqueuse gingivale. Le surnageant et les tissus pourront ensuite être utilisés pour analyser les différentes composantes cellulaires afin de voir l’interaction de l’anéthol dans l’environnement. L’objectif à poursuivre est de développer un modèle animal de cancer buccal afin de voir l’effet de l’anéthol dans un modèle in vivo. Bien qu’en 1995, al-Harbi et coll.[65] ont montré l’effet anticancéreux potentiel de l’anéthol sur un
modèle de tumeur d’ascite d’Ehrlich in vivo chez la souris, aucune étude n’a publié à ce jour l’effet in vivo de l’anéthol sur le cancer buccal. Ainsi, il sera ensuite question d’établir la dose idéale et le mode d’administration. La compréhension du mode d’action de l’anéthol sur un modèle animal sera primordiale pour l’avancement de ce projet et du potentiel clinique que pourrait avoir l’anéthol chez l’humain.
En conclusion, l’anéthol contrairement à d’autres composés naturels décrits dans la littérature possède à faible dose une toxicité élevée pour les cellules de cancer de la bouche et peu pour les cellules saines. Par conséquent, l’anéthol pourrait être un nouvel agent chimiothérapeutique puissant contre les carcinomes épidermoïdes gingivaux en modulant les molécules clés de la prolifération, de la mort cellulaire, de la migration, de l’invasion cellulaire et des voies de signalisation de l’EGFR et d’autres voies de signalisation liées au cancer.
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