L’industrie porcine est un rouage important de l’économie québécoise et canadienne. Pour demeurer compétitifs dans un marché mondial toujours plus imposant, les producteurs ont recours aux aliments médicamentés contenant des antibiotiques afin d’améliorer les performances de croissance des porcelets. Cette pratique est cependant sévèrement critiquée par la population et les scientifiques, dû à la possible acquisition de résistances par les bactéries pathogènes animales et humaines. Les microorganismes probiotiques nous apparaissent comme une solution de rechange très prometteuse à l’utilisation des antibiotiques dans l’alimentation des animaux d’élevage. Par contre, l’approfondissement des connaissances des mécanismes d’action spécifiques des souches probiotiques est nécessaire pour optimiser leur utilisation. Les buts de ce projet de recherche étaient d’évaluer les effets modulatoires de Pediococcus acidilactici MA18/5 M (PA) et Saccharomyces cerevisiae ssp. boulardii CNCM I-1079 (SCB), premièrement, sur les populations bactériennes intestinales avant et après sevrage et, deuxièmement, sur des marqueurs de l’immunité innée et acquise en contexte d’infection entérique causée par Salmonella Typhimurium DT104.
L’effet de l’administration quotidienne des probiotiques sur le microbiote intestinal a été évalué une première fois lors de la lactation alors que les porcelets étaient âgés de 10 jours. Les analyses par T-RFLP effectuées sur les fèces recueillies ont révélé que les traitements probiotiques influencent peu l’équilibre global du microbiote, évalué par le calcul des indices de diversité, le pourcentage relatif des principaux Phylum et les analyses MRPP sur les représentations tridimensionnelles des NMS obtenues à partir des profils T-RFLP. Selon toute vraisemblance, la consommation du colostrum et du lait qui sont riches en facteurs immunologiques et en facteurs de croissance, est le principal facteur influençant l’équilibre global du microbiote fécal à ce stade de développement des porcelets. Cependant, les analyses par T-RFLP ont aussi démontré que les traitements probiotiques favorisaient l’implantation de certaines familles bactériennes que nous considérons comme des populations majeures du microbiote, avec une abondance relative de 5% et plus. En fait, l’administration de PA était caractérisée par l’implantation de familles bactériennes du Phylum des Firmicutes, tandis que l’administration de SCB favorisait l’implantation de
bactérie de la famille des Flavobacteriaceae (phylotype de 85 pb) qui appartient au Phylum des Bacteroidetes. Autre fait notoire, la coadministration de PA et SCB ne reflétait pas leurs effets individuels sur le microbiote fécal, mais possédait ses propres effets modulatoires, étant caractérisé par la présence d’un phylotype majeur associé à la famille des Lactobacillaceae (phylotype de 177 pb) et par le phylotype de 129 pb identifié comme un membre de la famille des Bifidobacteriaceae. Pour bien comprendre l’impact sur l’hôte des modulations observées sur les familles bactériennes par nos traitements probiotiques lors de la lactation, des études supplémentaires sont nécessaires pour premièrement, mieux caractériser ces populations bactériennes et deuxièmement, évaluer si ces modulations ont des effets positifs sur le développement morphologique et immunitaire des porcelets. C’est à 28 jours d’âge, soit une semaine post-sevrage, que les effets modulatoires de l’administration des traitements probiotiques ont de nouveau été évalués au niveau des fèces des mêmes porcelets échantillonnés lors de la lactation. En complément, pour être représentatif de la réalité de l’industrie porcine nord-américaine, suite au sevrage, un groupe d’animaux recevant la même alimentation de base que les animaux du groupe témoin, mais supplémenté avec de la tiamuline et de la chlortétracycline, a été ajouté et utilisé comme groupe de référence. Nos dénombrements sur milieux sélectifs ont montré que l’administration de PA favorisait l’implantation des bifidobactéries comparativement à une alimentation de base. Il demeure important de noter que la culture de microorganismes ne parvient pas à reproduire la diversité complète rencontrée dans des environnements complexes. Malgré l’utilisation de milieux sélectifs, certains microorganismes ciblés ne peuvent parfois pas se multiplier de manière adéquate, influençant du même coup la validité des résultats. Il n’en demeure pas moins que cette technique peut être utilisée comme référence pour visualiser les effets modulatoires des probiotiques sur certaines populations bactériennes majeures du microbiote intestinal. L’analyse par T-RFLP des échantillons recueillis a démontré qu’après seulement une semaine de consommation par les porcelets, les antibiotiques avaient un impact majeur sur la balance globale du microbiote fécal, tandis que les traitements probiotiques n’influençaient pas de façon significative les paramètres évalués. Au sevrage, le changement d’alimentation provoque une importante modulation du microbiote intestinal. Les glucides devenant la principale source énergétique au lieu des lipides, l’équilibre entre les différentes populations
bactériennes est modifié pour se stabiliser de nouveau deux à trois semaines plus tard (293). Il semble donc que, suite au sevrage, l’incorporation d’antibiotique dans l’alimentation influencerait davantage le remodelage du microbiote fécal que les microorganismes probiotiques déjà présents dans l’écosystème intestinal. La consommation de faible dose d’antibiotiques par les porcelets favoriserait l’établissement de populations bactériennes bénéfiques pour la santé intestinale de l’hôte limitant du même coup le développement de bactéries pathogènes opportunistes qui pourraient profiter de l’instabilité du microbiote provoquée par le sevrage pour coloniser la muqueuse intestinale et causer une infection entérique. D’autres études sont cependant nécessaires pour valider cette hypothèse et pour approfondir l’impact de l’effet des antibiotiques observé dans cette étude sur le microbiote. De plus, il serait intéressant de caractériser le microbiote iléal et colique de porcelets de même âge, car l’analyse des populations bactériennes fécales n’est pas représentative du microbiote retrouvé au niveau des différents compartiments composant le système digestif. Ainsi, l’analyse de ces sites pourrait possiblement révéler des effets des traitements probiotiques sur le microbiote intestinal des porcelets autant lors de la lactation qu’une semaine post-sevrage.
L’effet modulatoire des probiotiques sur le microbiote a finalement été évalué, deux semaines suite au sevrage, au niveau de deux segments majeurs du tube digestif, soit l’iléon et le côlon. Premièrement, au niveau du microbiote iléal, les analyses T-RFLP ont montré que l’administration de SCB augmentait l’abondance relative des Firmicutes et favorisait l’implantation d’un phylotype majeur associé à la famille des Lactobacillaceae (phylotype de 175 pb). De plus, il s’est avéré que l’administration d’antibiotiques ou de PA seul influençait de façon similaire l’équilibre global du microbiote. En fait, nos résultats ont montré que les antibiotiques et PA réduisaient la diversité du microbiote iléal des porcelets sevrés et favorisaient l’établissement des Firmicutes en avantageant l’implantation d’une population bactérienne associée à Lactobacillus amylovorus (phylotype de 177 pb). Fait intéressant à noter, la coadministration de PA et de SCB ne reflète pas les effets individuels sur le microbiote iléal de PA et SCB lorsqu’administré seul. Il a été montré récemment que la chlortétracycline utilisée comme facteur de croissance dans l’alimentation des porcelets sevrés module le microbiote iléal en diminuant les quantités de Lactobacillus johnsonii et de Turicibacter tout en augmentant la proportion de L. amylovorus (263). Lactobacillus
amylovorus est un type bactérien abondant dans l’intestin du porcelet et certaines souches posséderaient une activité antimicrobienne contre les pathogènes entériques, tel que démontré in vitro et in vivo dans d’autres études (155, 156, 270). De plus, cette espèce de lactobacille est amylolytique et peut donc contribuer au métabolisme de l’amidon présent en grande quantité dans l’alimentation et ainsi avoir un possible impact sur le gain de poids des animaux, tel qu’observé dans d’autres études utilisant P. acidilacticii comme probiotique (64, 164) ou encore la chlortétracycline comme facteur de croissance (262). Bien que notre étude n’ait pas démontré d’effet sur la croissance des animaux, il n’en demeure pas moins lorsqu’on considère les résultats obtenus au niveau du microbiote iléal que PA semble être un candidat potentiel pour remplacer les antibiotiques comme supplément alimentaire. Cependant, d’autres études dans des conditions industrielles sont nécessaires pour confirmer nos observations et optimiser les conditions d’utilisation. Finalement, toujours deux semaines post-sevrage, l’effet de nos traitements sur le microbiote colique a été évalué. Les analyses T-RFLP ont démontré que les porcelets consommant PA seul possédaient une abondance relative d’Actinobacteria plus élevée que les porcelets recevant une alimentation de base. Cet effet était aussi appuyé par le phylotype de 129 pb associé à la famille des Bifidobacteriaceae qui était caractéristique du microbiote colique des porcelets du traitement PA. Généralement, une proportion élevée de Bifidobacteriaceae qui regroupe les bactéries du genre Bifidobacterium, est associée à une bonne santé intestinale (153). Cependant, ce phylotype représentait seulement 2% du microbiote colique. Avec une si faible proportion, il est difficile de savoir si cet effet modulatoire de PA a un impact réel sur la santé intestinale de l’hôte. Nos analyses ont aussi permis de démontrer que l’administration de SCB influençait de façon importante le microbiote du côlon en augmentant la diversité et en favorisant l’implantation de deux familles bactériennes, soit les Porphyromonadaceae et les Ruminococcaceae (phylotype de 89 et 292 pb, respectivement). Dans le côlon, ces deux familles sont parmi les plus actives métaboliquement (111). De plus, il a été démontré que les Ruminococcaceae jouent un rôle important dans la fermentation colique en utilisant la pectine et la cellulose non digérée pour produire du butyrate (266). Le butyrate est un élément important au niveau du côlon puisque plus du trois quart de celui-ci est utilisé par les colonocytes comme source d’énergie (268). Il a aussi été démontré que le butyrate renforce les barrières de défense
épithéliales en induisant la sécrétion de mucines et de peptides antimicrobiens (341). Ces effets de SCB peuvent donc être d’un grand intérêt dans la défense contre les pathogènes intestinaux et dans le maintien d’une homéostasie et d’une santé intestinale adéquate. Malgré tout, il est important de mentionner que la technique T-RFLP permet d’évaluer l’abondance relative des populations présentes dans un écosystème, mais ne représente pas les populations métaboliquement actives dans cet écosystème (306). D’autres études sont donc nécessaires pour premièrement confirmer que les populations bactériennes modulées par nos traitements probiotiques sont actives métaboliquement et, deuxièmement, évaluer l'impact de ces modulations sur la santé intestinale de l’hôte, que ce soit pour l'effet de PA sur les bifidobactéries ou de SCB sur les Ruminococaceae et les Porphyromonadaceae. Dans ce projet de recherche, l’influence des traitements probiotiques et antibiotiques sur la barrière épithéliale intestinale et l’immunité en contexte d’infection à S. Typhimurium DT104 a aussi été évaluée chez le porc sevré. Pour ce faire, nous avons analysé la colonisation intestinale et la translocation du pathogène vers les ganglions mésentériques (GM), la sécrétion d’IgA, l’expression de certaines cytokines au niveau de l’iléon et des GM et, finalement, la proportion des populations de cellules immunitaires dans le sang et les GM. Des porcs âgés de 43 jours ont été infectés oralement avec une souche de S. Typhimurium DT104 et 24 heures plus tard, les porcs étaient euthanasiés. Lors de l’euthanasie, des signes d’infection étaient visibles, tous les porcs montrant des fèces de modérément à très liquide. Cette observation a ensuite été appuyée par l’isolement de salmonelles viables au niveau des GM et dans les contenus de l’iléon et du côlon chez tous les porcs. Malgré tout, les comptes de Salmonella sur milieu sélectif n’ont montré aucun effet des traitements probiotiques ou antibiotiques. De façon similaire, la concentration d’IgA sécrétoire au niveau de la muqueuse iléale et l’expression des cytokines, IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-10 et IL-4, que ce soit au niveau de l’iléon ou des GM n’ont pas été affecté par l’administration des probiotiques. Toujours dans le même ordre d’idée, 24 heures suite à l’infection, l’analyse des populations cellulaires au niveau des GM n’a montré aucun effet des probiotiques ou des antibiotiques utilisés. Cependant, que ce soit avant ou après le challenge expérimental, des effets sur les populations de cellules immunitaires du sang ont été obtenus. Avant l’infection, à 39 jours d’âge, les porcs recevant seulement SCB possédaient une quantité supérieure de lymphocytes T CD4+CD8+. Lors de leur
développement, les lymphocytes T passent par un stade où ils deviennent double-positifs (CD4+CD8+) pour éventuellement devenir des cellules simple-positives (CD4+CD8‾ ou CD4‾CD8+). Cet effet de SCB sur le pourcentage relatif des lymphocytes T double-positifs est difficilement explicable. Cependant, il est possible de croire qu’en cas d’infection un animal ayant une quantité plus importante de lymphocytes double-positifs aura une réponse immune plus rapide contre le microorganisme pathogène qu’un animal où le nombre de cellules immunitaires en développement est moindre. Toutefois, suite à l’infection expérimentale avec S. Typhimurium, les paramètres évalués n’ont pas appuyé cette hypothèse. Toujours à 39 jours d’âge, notre étude a démontré que les porcelets du groupe PA+SCB avaient dans leur sang une quantité supérieure de lymphocytes T CD4‾CD8+ et de CD4‾CD8+high. De plus, le pourcentage relatif des monocytes/macrophages était moins élevé chez les porcelets recevant PA+SCB. Les lymphocytes CD4‾CD8+ sont généralement considérés comme étant des cellules cytotoxiques, responsables de l’élimination des cellules infectées par des virus ou des bactéries pathogènes intracellulaires (39, 342). Cette population de lymphocyte comprend les cellules NK et les lymphocytes T cytotoxique (62, 159, 342). Tandis que les monocytes/macrophages sont des cellules très polyvalentes qui jouent plusieurs rôles. Ce sont des cellules phagocytaires spécialisées qui contribuent à protéger l’hôte contre les substances étrangères néfastes et les microorganismes infectieux. Les macrophages n’ont pas seulement un rôle important au niveau de l’immunité innée, mais sont aussi indispensables pour l’activation de diverses populations de lymphocytes indispensable à l’établissement d’une réponse immunitaire spécifique contre le type de pathogène rencontré (immunité adaptative) (214). Les macrophages comme les cellules dendritiques, sont des cellules présentatrices d’antigène qui jouent un rôle majeur dans l’initiation d’une réponse immunitaire. Les monocytes et les macrophages sont également des cellules sécrétoires impliquées dans le développement d’une réponse inflammatoire qui stimule les lymphocytes et les autres cellules immunitaires à répondre adéquatement à l’agent pathogène envahisseur. Fait intéressant, nos résultats ont montré que la présence à la fois de PA et de SCB est requise pour influencer la quantité de lymphocyte T CD4‾CD8+ et de monocyte/macrophage dans le sang, ce qui indique qu’il y a un effet synergique entre les deux probiotiques. Cette étude suggère aussi que l’administration de SCB seule ou en combinaison avec PA, a le potentiel de moduler l’immunité systémique des porcelets suite
au sevrage. Le mécanisme d’action n’est pas clair et il est difficile de conclure que ces effets sur l’immunité sont bénéfiques pour l’hôte puisqu’aucun effet positif n’a été obtenu sur la colonisation intestinale du pathogène, la production d’IgA sécrétoire ou l’expression des cytokines évaluées dans cette étude, suite à une infection de 24 heures avec S. Typhimurium.
Cette étude a aussi permis de démontrer qu’une infection entérique de 24 heures causée par S. Typhimurium DT104 chez le porc, tous traitements confondus, provoquait une hausse dans le sang des lymphocytes T double-positif (CD4+CD8+), des lymphocytes T auxiliaires (CD4+CD8‾) et des monocytes/macrophages, mais diminuait la proportion de cellules productrices d’anticorps, soit les lymphocytes B. Finalement, toujours dans le sang 24 h suite à l’infection, les porcs des groupes PA+SCB et ATB montraient une tendance à posséder un pourcentage relatif de lymphocyte T cytotoxique (CD4‾CD8+) plus élevé. Tandis que l’administration de SCB seul ou en combinaison avec PA diminuait la quantité de cellules T auxiliaires (CD4+CD8‾). Malgré le fait qu’aucun effet positif des traitements probiotiques n’ait été obtenu pour les autres paramètres évalués, il n’est pas possible d’exclure que les effets modulatoires observés sur les populations de cellules immunitaires du sang aient une influence sur la durée de la période d’excrétion du pathogène en favorisant la montée plus rapide et plus efficace d’une réponse immunitaire adaptative. Il est aussi important de mentionner que les analyses ont été effectuées à un temps bien précis suite à l’infection et que la réponse immunitaire est variable dans le temps principalement au niveau de l’expression des cytokines que ce soit dans les GM ou au niveau de la muqueuse iléale. D’autres études sont donc nécessaires pour évaluer premièrement à différents temps l’effet des probiotiques sur le profil d’expression des cytokines et, deuxièmement, étudier l’impact de PA et SCB sur la durée et la sévérité d’une infection à Salmonella.
En conclusion, cette étude a permis d’établir que PA et SCB ont des effets modulatoires modérés sur le microbiote fécal global des porcelets que ce soit lors de la lactation ou à une semaine post-sevrage. Par contre, des impacts majeurs sur le microbiote sont observés au niveau des compartiments internes de l’intestin. L’administration de PA ayant un impact important au niveau du microbiote iléal, et ce, de façon similaire à l’ajout d’antibiotiques dans l’alimentation, tandis que SCB influence le microbiote du côlon. Fait intéressant,
autant au niveau du microbiote fécal suite au sevrage qu’au niveau de l’iléon et du côlon, la coadministration de PA et SCB semble abolir les effets individuels de ces deux microorganismes lorsqu’administré seul. Ce projet a aussi permis de mettre à jour les effets modulatoires de SCB seul ou en combinaison avec PA sur l’immunité systémique suite au sevrage et ce, autant en condition normale que lors d’une infection entérique causée pas S. Typhimurium. Bien que cette étude ait permis d’améliorer les connaissances entourant les mécanismes d’action des probiotiques sur le microbiote intestinal et le système immunitaire, des projets de recherche doivent encore être conduits pour poursuivre l’approfondissement des connaissances visant à évaluer les impacts des probiotiques sur la santé intestinale et générale de l’hôte, et pour optimiser l'utilisation des probiotiques comme alternative aux suppléments d'antibiotiques dans l'élevage.
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