Discussion et perspectives

Les résultats présentés dans cette partie traitent de la caractérisation enzymatique de FadD32 de M. tuberculosis (mtFadD32) : une protéine essentielle à la survie des mycobactéries.

La protéine mtFadD32 étudiée a été produite de manière hétérologue chez E. coli et possède in vitro l’activité acyl-AMP ligase attendue (publication 1). L’étude des propriétés cinétiques de l'enzyme a montré que FadD32 possédait la plus forte affinité (Km le plus faible)

pour l'acide gras en C16 et les meilleures efficacités catalytiques (kcat/Km) pour le C16:0 et le

C14:0 (Figure 21). Ces propriétés distinguent FadD32 des autres acyl-CoA synthétases

bactériennes comme (i) MIG de M. avium, dont la spécificité de substrat est principalement centrée sur le C10 (Morsczeck et al., 2001) ; mais également (ii) FadK et FadD de E. coli qui

présentent un profil de spécificité de substrat centré respectivement sur le C6-C8 (Morgan-Kiss

and Cronan, 2004) et sur le C12 (Kameda and Nunn, 1981). Le substrat potentiel in vivo de

mtFadD32 est l’acide méromycolique constitué de 54 à 64 atomes de carbone, afin de s’approcher des caractéristiques de ce substrat nous avons testé des substrats plus longs (C20

et C24) et plus proche de la conformation de son substrat potentiel in vivo (C18:1Δ13). En effet,

les travaux récents de Zuber et Hoffman (Zuber et al., 2008) ; (Hoffmann et al., 2008) permettent de postuler que la chaîne méromycolique pourrait avoir une conformation particulière en « N », par un repliement de la chaîne carbonée au niveau des groupements fonctionnels. Afin de tester cette hypothèse, nous avons synthétisé le C18:1Δ13, un substrat

« mimétique » de la chaîne méromycolique. La double liaison de conformation cis en position 13 mime une « décoration » proximale de la chaîne méromycolique. Ce substrat serait ainsi plus proche structuralement de la conformation putative en « N » de la chaîne méromycolique qu’un acide gras saturé. Pour tester ce substrat « mimétique » et des substrats acides

présence d’un « effet détergent » pour les substrats supérieurs au C16 ne nous a pas permis

d’étudier l’affinité de FadD32 pour ce substrat. La mise au point d’un essai non radioactif permettra de comparer l’affinité de FadD32 pour les termes en C18 (C18, C18 :1Δ9, C18 :1Δ13). Les

analogues de substrats AMPC12, C16, C18 et C20 utilisés au cours de l’étude d’inhibition de l’activité de FadD32 nous ont renseignés de manière indirecte sur la spécificité de substrat de l’enzyme. Ces expériences préliminaires d’inhibition doivent être confirmées, mais elles nous apprennent que l’inhibition de l’activité de FadD32 la plus importante est observée in vitro pour l’inhibiteur possédant une chaîne alkyl de 12 carbones (AMPC12) et la plus faible pour l’AMPC20. Ce résultat pourrait suggérer que la poche de fixation du substrat acide de l’enzyme est moins adaptée pour des substrats longs. La faible efficacité d’inhibition de l’AMPC20 viendrait d’un mauvais positionnement de la chaîne alkyle qui limiterait également l’interaction de l’AMP avec les acides aminés intervenant dans la fixation de l’ATP. En extrapolant ce schéma à un substrat acide gras en C20 saturé, on peut supposer que

la fonction carboxyle de l’acide serait mal positionnée par rapport aux acides aminés catalytiques, diminuant de ce fait l’activité de l’enzyme. L’hypothèse proposée sur la conformation en N du substrat de FadD32 serait ainsi privilégiée. La différence d’inhibition observée entre l’AMPC12 et l’AMPC20 pourrait également être due à une différence de solubilité entre les deux composés en faveur de l’analogue possédant la chaîne alkyl la plus courte.

Deux autres hypothèses « non éprouvées » peuvent être envisagées pour expliquer la « faible » activité de FadD32. L’une d’entre elles serait l’absence lors de la production de FadD32 de manière hétérologue chez E. coli , d’une modification post-traductionnelle nécessaire à son activité. Des modifications post-traductionnelles ont été décrites dans la littérature, notamment pour l’acétyl-CoA synthétase (Starai et al., 2002) et la « long chain acyl-CoA synthetase » (ASC1) du foie du rat (Distler et al., 2007). L’importance de la modification des protéines par acétylation réversible dans le métabolisme intermédiaire émerge juste. Il a été démontré récemment, que les deux isoformes de l'acétyl-CoA synthétase (cytosolique : AceCS1 et mitochondrial : AceCS2) sont acétylés de manière réversible, entraînant la perte de fonction (acétylation) ou le gain en fonction (désacétylation) (Starai et al., 2002) ; (Hallows et al., 2006) ; (Schwer et al., 2006). Il a été proposé que l'acétylation module l'activité de toutes les enzymes d’adénylation (Starai et al., 2002). La phosphorylation et la nitration ont également été observées sur ACS1, mais leur rôle biologique reste encore inconnu (Distler et al., 2007). Afin d’évaluer l’importance d’une modification post-

système hétérologue favorisant potentiellement la mise en place de la modification est à l’étude. Les systèmes de production envisagés sont la bactérie M. smegmatis ou le système "Baculovirus-cellules d'insectes". Une autre hypothèse possible pour expliquer la « faible » activité de FadD32 serait qu’in vivo, elle formerait un « complexe de condensation » avec ces protéines partenaires AccD4 et Pks13. La formation de ce complexe pourrait entraîner des modifications conformationnelles nécessaire pour l’activité « optimale » de FadD32.

Quelque soit les hypothèses, l’essai enzymatique avec des substrats marqués au 14C a montré ses limites. La mise au point d’un essai enzymatique non radioactif et robuste nous permettrait de tester les différents substrats et d’aller plus loin dans la compréhension du mécanisme réactionnel de l’enzyme.

Les enzymes d’adénylation catalysent généralement deux demi-réactions, et les cas d’enzymes catalysant uniquement la formation d’intermédiaire adénylate ont été décrits pour la première fois avec les FAAL de M. tuberculosis (Trivedi et al., 2004). Ces mêmes travaux ont suggéré sans le démontrer que les FAAL seraient capables de « transférer » leur produit « adénylé » sur des domaines ACP proches. Au cours de la caractérisation enzymatique de FadD32, nous avons donc cherché à découvrir quel était l’accepteur final de la réaction. Les travaux récents portant sur une acyl-CoA synthétase de Vibrio harveyi illustrent la frontière parfois ténue qui existe entre les différentes activités « acyl-ligase ». La caractérisation enzymatique de cette enzyme annotée comme « Fatty acyl-CoA synthetase » a conduit les auteurs à démontrer qu’elle possédait en réalité une activité acyl-ACP synthétase (Jiang et al., 2006). Nos travaux ont permis de déterminer que FadD32 était capable d’acyler l’ACP mycobactérien (ou AcpM). FadD32 ne serait donc pas une simple ''Fatty acyl-AMP ligase'', comme cela a été suggéré précédemment (Trivedi et al., 2004). A l’instar des autres enzymes d’adénylation, FadD32 catalyserait deux demi-réactions : (i) la production d’un acyl-AMP à partir d'un acide gras et d'ATP, suivie (ii) de la formation d’un lien thioester entre la chaîne acyle de l'acyl-AMP et le groupement thiol du bras P-pant de son accepteur final : l’ACP. Cet accepteur serait probablement, dans le cas de FadD32, le domaine ACP-Nter de Pks13. L’activité de transfert proposée précédemment pour les FAAL (Trivedi et al., 2004) a maintenant été démontrée pour FadD32. Cette activité acyl-ACP ligase de FadD32 pourrait se généraliser aux autres FAAL de M. tuberculosis. Pour argumenter cette hypothèse, l’analyse de l’environnement des gènes fadD de M. tuberculosis, a montré que parmi les 12 protéines FAAL, 9 ont leur gène situé à proximité d’une séquence codante un acp ou un acp-like.

susceptibles de posséder l’activité enzymatique pour produire des dérivés ACP ou PCP (Peptidyl Carrier Protein). Les enzymes FadD pourraient posséder une spécificité de substrat différente vis-à-vis de l’accepteur P-pant final : le CoA pour les FACL, à l’ACP pour les FAAL. L’ACP serait soit libre, soit partie intégrante d’une protéine multi-domaine comme les Pks ou les NRPS. La résolution de la structure tridimensionnelle de FadD28 (ou FAAL28) a conduit à l’identification d’une séquence d’acides aminés propre aux FAAL qui semblerait être à l’origine de la différence d’activité entre les deux sous-familles (Arora et al., 2009). Ce motif d'insertion conservé chez les FAAL modifierait les mouvements du domaine C- terminal, empêchant la deuxième demi- réaction de se produire. Cette insertion serait donc à l’origine de l’impossibilité pour les FAAL de catalyser la formation d’acyl-CoA. Nos données sur l’activité acyl-ACP ligase de FadD32 pourraient offrir un autre angle d’interprétation de la présence de cette insertion d’acides aminés. Ce motif d'insertion qui altère la flexibilité du domaine Cter ne servirait-il pas à discriminer l’accepteur final CoA, ACP, AcpM ou domaine ACP/PCP des protéines partenaires ? Les réactions d’adénylation et de formation de la liaison thioester s’effectuent à l’interface entre les deux domaines Nter et Cter caractéristiques des enzymes d’adénylation. Il est alors possible d’envisager que l’altération de flexibilité du domaine Cter pourrait laisser un espace interdomaine suffisant pour permettre à l’ACP (plus volumineux que le CoA) d’accéder au site actif réalisant la formation de la liaison thioester.

Le passage de « FadD32 cible potentielle » à « FadD32 cible validée » pour la recherche de nouveaux médicaments antituberculeux peut être envisagé. En effet, nous avons, d’une part, montré que les adénosines 5’-alkyl phosphate (AMPC12, 16, 18, 20), inhibaient l’activité acyl-AMP ligase de FadD32, et d’autre part, nous avons montré qu’en utilisant un inhibiteur qui cible les FadD, la croissance des mycobactéries était inhibée. De plus, l’AMPC12 représente un outil prometteur pour l'étude structurale de FadD32. En co- cristallisation avec la protéine FadD32, cet inhibiteur pourrait permettre, dans un premier temps, de stabiliser la protéine et, dans un second temps, de fournir des informations sur la conformation adoptée lors de l’étape de formation de la liaison thioester avec l’accepteur ACP.

Figure 27 : Mécanisme réactionnel proposé pour le couple FadD32-Pks13 et interrogations sur les étapes catalytiques (Gohkale et al., 2007).

Selon le modèle, FadD32 activerait la chaîne méromycolique sous forme d’acyl-AMP (1) et la transférerait sur un groupement thiol du phosphopantéthéine lié au domaine ACP de Pks13 pour former un acyl-S-ACP (2) La chaîne α carboxylée par le complexe Acyl-CoA carboxylase (AccD4 et AccA3) serait transférée sur le groupement thiol du phosphopantéthéine lié au domaine ACP (probablement le Cter) de Pks13, par le domaine AT (3). La fixation des deux substrats serait suivie par une condensation « décarboxylative » de type Claisen catalysée par le domaine KS qui aboutirait à la formation du β-cétoester (4).

(i) Sur quel domaine ACP se fixe la chaîne méromycolique? (ii) La chaîne méromycolique est- elle réellement transférée sur Pks13 par FadD32? (iii) Quel est le mécanisme réactionnel catalysées par Pks13 au cours de la condensation?

?

?

(i)

(ii)

(iii)

2

4

1

3

Partie 2 Etude et « dissection » du mécanisme catalytique du