Discussion

Nous avons démontré par cette étude que l'enzyme Pks13 de M. tuberculosis possède une activité de condensation in vitro et qu’elle est capable de synthétiser, en réaction couplée avec FadD32, les précurseurs des acides mycoliques, les α-alkyl β-céto acides, à partir d'un acyl- AMP et d’un 2-carboxyacyl-CoA.

La fonction enzymatique de Pks13 a été étudiée en présence de substrats à chaîne plus courte que ses substrats naturels présumés (C24-C26 carboxyacyl-CoA et C50-C60

méromycoloyl-AMP), pour des raisons de solubilité et de disponibilité des substrats. Nos travaux ont montré que l’enzyme Pks13 de M. tuberculosis est capable de condenser des substrats à chaîne courte (C12, C16) pour former des α-alkyl β-céto acides en C32. Ces résultats

corrèlent avec des données non publiées sur la complémentation hétérologue du mutant Δpks13 de C. glutamicum par pks13 de M. tuberculosis qui maintient la production des acides mycoliques caractéristiques des corynébactéries en C32-C34 (communication personnelle de

Christine Houssin). La protéine Pks13 de M. tuberculosis ne semble pas présenter une grande spécificité vis-à-vis de la longueur de la chaîne de ses substrats. Cette spécificité de substrat pour les chaînes méromycoliques en C50-C60 et C24-C26 pour la ramification alpha des acides

mycoliques pourrait être contrôlée par les enzymes partenaires de Pks13 qui activent ses substrats : FadD32 et le complexe acyl-CoA carboxylase formé par AccA3-AccD4, respectivement. Des travaux récents ont en effet montré que le complexe de carboxylation AccA3-AccD4 de M. tuberculosis ne présentait aucune activité pour les acyl-CoA dont la longueur de chaîne était inférieure à son substrat in vivo : C24-C26 (Oh et al., 2006). Ces

résultats sur la spécificité de substrat du complexe de carboxylation AccA3-AccD4 vont dans le sens d’une sélectivité de substrat probablement assurée par les partenaires de Pks13, AccD4 et FadD32.

La caractérisation des différentes étapes de la condensation permet de proposer le modèle présenté en Figure 28. Le carboxyacyl-CoA, préalablement activé par le complexe de carboxylation, est chargé sur l’ACP Cter de Pks13 (ACPPks13-Cter) via son domaine AT et la

chaîne acyle de l’acyl-AMP produite par FadD32 en présence d'acide gras et d’ATP est spécifiquement transférée sur le domaine ACP Nter de Pks13 (ACPPks13-Nter). Afin de

confirmer l’implication de FadD32 lors de l’étape d'acylation de la chaîne méromycolique sur Pks13, des expériences in vitro ont été menées sur le couple FadD32-Pks13. La spécificité de chargement de FadD32 sur le domaine ACP-Nter a été étudiée en utilisant une protéine Pks13

Figure 28 : Schéma des étapes enzymatiques de la condensation mycolique catalysées par le couple FadD32-Pks13. (Publication 2)

FadD32 synthétiserait le méromycoloyl-AMP à partir de l’acide méromycolique et de l'ATP (1) La chaîne « méromycoloyle » de cet intermédiaire est ensuite fixée par FadD32 sur le bras P- pant du domaine ACP-Nter de Pks13 (2). La chaîne « méromycoloyle » est ensuite transférée sur le domaine KS (3). Le carboxyacyl-CoA est spécifiquement chargé sur le domaine AT, qui catalyse la fixation covalente de la chaîne « carboxyacyle » sur son site actif (1’) et son transfert spécifique sur le domaine ACP-Cter (2’). Le domaine KS catalyse la condensation de type Claisen entre les chaînes « méromycoloyle » et « carboxyacyle » pour produire un α-alkyl β-cétothioester lié au domaine ACP-Cter (3’). Le domaine thioestérase catalyse probablement la libération de la chaîne α-alkyl β-cétoacyl et son transfert sur un accepteur encore inconnu (X1) (4’).

possède que son domaine ACPPks13-Cter activé. FadD32 est incapable de fixer la chaîne acyle

de l’acyl-AMP sur Pks13 en absence de domaine ACP Pks13-Nter activé. Cette sélectivité de

FadD32 pour le domaine ACP-Nter pourrait s’expliquer par la faible homologie de séquence entre les deux domaines ACP de Pks13 (24% d'identité seulement). La spécificité entre une enzyme d’adénylation vis-à-vis d’une protéine ACP a déjà été décrite dans la littérature pour la NRPS responsable de la biosynthèse de la quinoxaline chez une espèce de Streptomyces (Schmoock et al., 2005). Les auteurs ont démontré que l’activation sous forme d’adénylate et le transfert du QA (acide quinoxaline-2-carboxylique) sur le domaine AcpPSE sont assurés spécifiquement par le domaine d’adénylation TrsI, qui ne peut être remplacé par des domaines d’adénylation d’autres NRPS l’ACMSI (actinomycine), ou MkmsI (etamycine). Ces résultats suggèrent qu’il existe un lien fonctionnel étroit entre domaine d’adénylation et domaine ACP. Afin d’étudier la spécificité du couple FadD32-Pks13, FadD32 a été remplacée par d’autres FadD mycobactériennes : FadD26 de Mycobacterium bovis, FadD29 de M. tuberculosis et l’homologue de FadD19 de Mycobacterium avium maMIG. Ces expériences ont montré que FadD32 pouvait être remplacée dans sa capacité de transfert sur Pks13 par FadD26 ou FadD29 qui appartiennent à la même sous-famille des FAAL, mais pas par maMIG (une FACL fonctionnant en FAAL en absence de CoA) (cf. § Résultat Chapitre II III.B). Cependant, la réaction de condensation n’a pas été observée en présence de FadD26 (FadD29 n’a pas été testée). Comment expliquer que le substrat transféré par FadD26 sur Pks13 ne puisse être condensé avec le carboxyacyl-CoA par la polykétide synthase ? Plusieurs hypothèses peuvent être avancées, (i) le transfert effectué par la FAAL de remplacement sur Pks13 ne s’effectue pas sur le domaine ACP-Nter ; (ii) Le mécanisme de condensation est dépendant d’une interaction protéine-protéine entre FadD32 et Pks13. Cette interaction privilégiée participerait à un repliement nécessaire de la PKS pour les étapes de transfert et de catalyse propres à la réaction de condensation. De manière intéressante, FadD32 de M.

tuberculosis présente une longue insertion au niveau de son domaine C-terminal appelée S4

(cf. Figure 2 Publication 1). Cette insertion spécifique est absente chez toutes les autres FAAL et, d’une manière générale, chez les enzymes d’adénylation examinées. Elle pourrait jouer un rôle dans la spécificité d’interaction avec Pks13 au cours de l’étape de transfert et de catalyse. La protéine FadD32 telle qu’elle a été produite et purifiée, se comporte en tant que monomère en chromatographie de perméation de gel (cf. Publication 1). Une ou plusieurs interactions pourraient être envisagées avec ses partenaires ; Pks13 et AccD4, avec qui elle formerait un « complexe de condensation ».

La mise en évidence de l’activité acyl-ACP ligase de FadD32, d’une part, et les résultats obtenus sur le couple FadD32-Pks13 d’autre part, confirme que FadD32 catalyserait l’activation de la chaîne méromycolique sous forme d’intermédiaire adénylate puis son transfert/liaison sur son accepteur final, le domaine ACP-Nter de Pks13, en deux demi- réactions.

Figure 29 : Schéma de la biosynthèse des DIM et des PGL (adapté de Siméone R., Léger M.

et al. Soumis)

Ce schéma reprend les données de la littérature sur les voies de biosynthèse des DIM et des PGL, en soulignant l’implication des 4 FadD du cluster « DIM + PGL ». FadD29 pourrait être une enzyme redondante par rapport aux 3 autres FadD du cluster « DIM + PGL » (D, A et C) ou l’enzyme responsable de l’étape de transfert entre Pks15/1 et PpsA (B).

Le « common lipid core » correspond à la chaîne de phtiocérol estérifiée avec des acides mycocérosiques. La structure des DIM et PGL est encadrée en bleu.

A B D C CH3 CH3 phtiocérol phénolphtiocérol

CHAPITRE II : Etude de FadD22, FadD26, FadD29, trois