Les affections parodontales sont des maladies inflammatoires affectant les tissus de soutien de la dent. Ce sont des infections polymicrobiennes rencontrées chez une grande proportion de la population, et plus fréquemment chez les adultes (4). Au-delà de 700 espèces bactériennes différentes sont présentes à l’intérieur de la cavité buccale. Toutefois, ce n’est pas l’intégralité de ces bactéries qui sont responsables du développement des maladies parodontales. En effet, seules certaines d’entre elles ont pu être associées à l’état pathologique. Notamment, les bactéries du complexe rouge, soit P. gingivalis, T. forsythia et T. denticola, sont reconnues comme les agents étiologiques de la parodontite chronique (28, 125). Lors du développement de cette maladie, la présence du biofilm bactérien dans les sites sous-gingivaux constitue un facteur essentiel, mais n’est pas responsable à lui seul de la destruction tissulaire caractéristique de la parodontite. En effet, une réponse immuno- inflammatoire incontrôlée en réponse à l’agression bactérienne est déclenchée et permet la progression de la maladie.
Au cours de la dernière décennie, bon nombre d’études ont été menées sur les composés naturels en vue de leur utilisation comme solution alternative aux médicaments conventionnels pour le traitement de diverses affections. En effet, plusieurs composés naturels ont des propriétés bénéfiques pour la santé humaine et auraient le potentiel d’être utilisés dans le traitement de diverses maladies, incluant les maladies parodontales. Des produits comme la canneberge, le curcuma, les agrumes ou encore les huiles essentielles ont fait l’objet d’études démontrant le potentiel prometteur de ces composés (126-129). Dans le cadre de ce projet, la capacité d’un extrait de thé vert et de sa composante principale, l’EGCG, à moduler l’expression de certains gènes chez P. gingivalis a été évaluée. Plusieurs effets bénéfiques du thé vert et de l’EGCG ont déjà été rapportés dans la littérature, notamment leur potentiel antioxydant, leur effet anti-inflammatoire et leur propriété anti-cancer (87-91, 93-97). De plus, certains de leurs effets en regard des problèmes buccaux, ont déjà été évalués. Par exemple, les polyphénols du thé vert peuvent neutraliser les composés sulfurés volatils causant l’halitose (105-107). De plus, ils peuvent inhiber les propriétés d’adhérence et la croissance de certaines bactéries comme S. mutans
et P. gingivalis, les principaux agents responsables de la carie dentaire et de la parodontite chronique, respectivement. Malgré ces découvertes, les mécanismes responsables de ces effets ne sont toujours pas clairement élucidés. De plus, peu d’études ont à ce jour évalué l’effet des polyphénols du thé vert et de l’EGCG sur l’expression de différents gènes bactériens.
Dans ce projet, la bactérie P. gingivalis a été étudiée. Ce choix a été justifié par le fait que cette espèce bactérienne est le principal agent étiologique de la parodontite chronique. De plus, P. gingivalis produit plusieurs facteurs de virulence qui lui permettent de coloniser et survivre à l’intérieur de la poche parodontale, tout en contribuant à la destruction tissulaire.
Dans un premier temps, une évaluation de l’effet de l’extrait de thé vert, sur la croissance de P. gingivalis a permis de démontrer qu’à une concentration minimale de 125 µg/ml, ce composé inhibe totalement la croissance de la bactérie. Dans une autre étude utilisant le même extrait de thé vert, une CMI (200 µg/ml) comparable à la nôtre avait été obtenue (124). Dans cette étude, d’autres extraits de thés (blanc, noir et Oolong) avaient également été testés et des CMI du même ordre de grandeur avaient été obtenues. Pour l’EGCG, une concentration minimale de 62.5 µg/ml a permis d’inhiber complètement la croissance de P.
gingivalis. Il est estimé que dans une tasse de thé vert, soit 2.5 g de feuille de thé dans
200 ml d’eau, environ 90 mg d’EGCG s’y retrouvent, pour une concentration finale de 450 µg/ml d’EGCG (130). Considérant ces données, il est fort logique de penser que les effets antibactériens liés à l’EGCG puissent se produire in vivo. D’autres études ont démontré que l’EGCG a également un effet sur la croissance d’autres bactéries buccales comme S. mutans et S. sobrinus (114). Divers mécanismes pourraient expliquer l’inhibition de la croissance observée. Par des essais de diffusion sur milieu gélosé, Yi et collaborateurs ont démontré que l’EGCG inhibe la croissance de Pseudomonas aeruginosa. Une analyse par microscopie électronique leur a permis de constater que l’EGCG entraîne une perte d’intégrité de la membrane externe chez la bactérie, inhibant ainsi la croissance bactérienne (131). Une seconde étude a démontré que l’EGCG inhibe la dihydrofolate réductase chez
Stenotrophomonas maltophilia, ce qui entraîne, entre autres une perturbation de la synthèse
inhibition de cette enzyme a également été rapportée lors d’une étude réalisée chez E. coli (133).
L’adhérence primaire de P. gingivalis à l’intérieur de la cavité buccale fait intervenir entre autres les fimbriae majeurs de type I (FimA) exprimés à sa surface. Ils sont essentiels à l’adhérence de la bactérie à la surface de la dent puisqu’ils permettent la coadhésion aux bactéries déjà présentes et l’adhésion aux surfaces (29-32). On retrouve également des hémagglutinines qui permettent la liaison de la bactérie à des récepteurs, comme les oligosaccharides présents sur les cellules humaines et qui permettent notamment l’adhésion de la bactérie à la surface des érythrocytes (35). Dans ce projet, l’évaluation de l’effet de l’extrait de thé vert et de l’EGCG sur l’expression des gènes codant pour les fimbriae et pour les hémagglutinines a permis de démontrer que, même à de faibles concentrations (50 µg/ml), l’extrait de thé vert diminue significativement l’expression de ces gènes. Également, l’effet observé s’est avéré dose-dépendant. L’EGCG est apparu également efficace, engendrant une diminution significative à 50 µg/ml pour le fimbriae et 62.5 µg/ml pour l’hémagglutinine A. L’effet de ces composés sur l’adhérence de P. gingivalis aux cellules épithéliales buccales a déjà été étudié par d’autres groupes de chercheurs. Sakanaka et collaborateurs ont rapporté que l’EGCG était en mesure de bloquer presque complètement l’adhérence de P. gingivalis aux cellules épithéliales à une concentration de 250 µg/ml (134). Plus récemment, notre équipe a démontré que l’extrait de thé vert, tout comme des extraits de thés noir, blanc et Oolong, diminuait à plus de 60% l’adhérence de la bactérie aux cellules épithéliales à une concentration de 25 µg/ml (124). Il a été proposé que les composantes du thé se lieraient spécifiquement ou non-spécifiquement à des molécules de surface de P. gingivalis empêchant ainsi son adhérence aux cellules épithéliales buccales. En effet, diverses études ont démontré la capacité de liaison des polyphénols à des constituants membranaires (135, 136). Une étude sur les mécanismes d’action de l’EGCG chez E. coli a démontré par microscopie électronique que le composé se fixait à la membrane externe. Plus spécifiquement, l’EGCG se liait aux résidus arginines de la porine OmpG, bloquant ainsi le canal OmpG responsable du transport de petites molécules hydrophiles (135). Une étude portant sur le virus de l’influenza a démontré que l’EGCG se lie aux hémagglutinines du virus bloquant ainsi sa capacité d’adhésion aux
cellules (136). Ces études permettent de suggérer que l’inhibition de l’adhérence serait due à la liaison des composés à des constituants membranaires. Toutefois, notre étude est la première à rapporter un mécanisme d’inhibition impliquant une modulation de l’expression de gènes laissant place à l’hypothèse que la diminution de la propriété d’adhérence, comme il a été démontré dans une étude antérieure, pourrait également résulter d’une diminution de l’expression des gènes.
Dans un deuxième temps, l’effet de l’extrait de thé vert et de l’EGCG sur l’expression des gènes codant pour les protéases a été étudié. Nous avons démontré que l’exposition de P.
gingivalis à des concentrations croissantes de ces deux composés engendre une diminution
significative et dose-dépendante de l’expression des gènes rgpA et kgp codant pour une Arg- et une Lys-gingipaïne, respectivement. Les protéases étant essentielles à plusieurs fonctions physiologiques et pathologiques chez P. gingivalis, différents groupes de chercheurs ont étudié les conséquences associées à une inactivation de ces gènes (rgpA,
rgpB, kgp). Grenier et collaborateurs ont démontré qu’un mutant de P. gingivalis déficient
pour la production de protéases devenait plus susceptible à l’action du complément et voyait sa capacité d’hémagglutination aux érythrocytes, sa capacité à proliférer efficacement dans le sérum humain et son pouvoir hémolytique diminués significativement (41). Une autre étude a démontré que l’inactivation du gène kgp entraînait une perte de la pigmentation des colonies de P. gingivalis sur gélose sang et une diminution des activités hémagglutinine et hémolytique de la bactérie (137). Pathirana et collaborateurs ont démontré, grâce à un modèle murin, que des mutants pour les protéases (RgpA, RgpB et Kgp) de P. gingivalis voyaient leur virulence diminuée. En effet, la capacité des mutants à coloniser la surface de la dent, à déclencher une réponse inflammatoire et à engendrer une résorption osseuse étaient affectées négativement (138). Un autre groupe de chercheurs, ayant démontré une perte de l’activité protéolytique chez des mutants de P. gingivalis, a voulu vérifier la virulence de ces mutants dans un modèle murin. Lorsqu’injecté chez la souris, les mutants de P. gingivalis ont démontré une virulence atténuée (139). Considérant les résultats des études précédentes, la capacité des polyphénols du thé vert à diminuer l’expression des gènes codant pour les protéases pourrait donc avoir plusieurs conséquences sur P. gingivalis.
De plus, Okamoto et collaborateurs ont démontré que les catéchines du thé vert, principalement les gallates, diminuaient significativement l’activité catalytique des protéases de P. gingivalis (140). Il a également été rapporté que les catéchines du thé vert inhibaient les activités protéolytiques de P. gingivalis, de façon similaire à ce qui avait été observé pour la doxycycline et les dérivés non-antimicrobiens modifiés de la tétracycline (141). En plus d’avoir un effet sur les protéases bactériennes, les polyphénols du thé vert affectent également l’activité des MMPs et leur production par les cellules de l’hôte. En effet, l’EGCG peut inhiber à la fois l’activité des MMPs et l’expression du gène codant pour certaines d’entre elles (119, 121, 142)
Une diminution de l’expression de FimA et des protéases par les polyphénols du thé vert pourraient également contribuer à réduire l’inflammation, car ces facteurs de virulence ont la capacité d’induire la production de cytokines entre autres par les monocytes et les macrophages (29, 54, 56).
Bien que les protéases de P. gingivalis puissent contribuer à l’hémolyse des érythrocytes (143), il a été démontré qu’une activité hémolytique est toujours présente malgré l’inactivation des gènes codant pour les protéases (137). Ceci résulte du fait que P.
gingivalis possède une hémolysine aussi impliquée dans la lyse des érythrocytes. Notre
analyse des effets du thé vert et de l’EGCG sur le gène de l’hémolysine (hem) montre que son expression est modulée négativement de façon dose-dépendante par les deux composés. L’extrait de thé vert a engendré une diminution significative de l’expression du gène à la CMI (125 µg/ml), mais un tel effet n’a pas été observé pour l’EGCG. Une étude réalisée chez S. aureus a démontré que l’expression des gènes codant pour l’-toxine (possédant une activité hémolysine) (hla et agrA) était diminuée par la licochalcone A (licA), un polyphénol de la famille des chalcones. De plus, à des concentrations sous-inhibitrices, licA est en mesure de diminuer jusqu’à 95% la production d’-toxine chez cette bactérie. (144). Cette étude suggère que la diminution de l’expression du gène de l’hémolysine pourrait être en lien avec une diminution de l’activité hémolytique de la bactérie. Il serait donc intéressant d’analyser la modulation de ce pouvoir hémolytique chez P. gingivalis pour mettre en corrélation les effets observés. D’autres produits naturels tels que le menthol,
l’eugénol et la naringénine ont également la capacité d’inhiber l’expression du gène codant pour l’-toxine chez S. aureus (145-147).
Des études réalisées chez d’autres bactéries, buccales et non-buccales, ont démontré une inhibition de l’expression des gènes impliqués dans la virulence par les polyphénols du thé vert. Ainsi, Lee et collaborateurs ont démontré que l’EGCG réduit l’expression des gènes (eae, escN, espA, sepZ et tir) responsables du quorum sensing chez E. coli O157:H7 (148). L’EGCG, à des concentrations sous-inhibitrices, a également engendré une inhibition chez
S. mutans de l’expression du gène gtf codant pour la glucosyl transférase qui est impliquée
dans la formation du biofilm (149). Un autre groupe de chercheurs a démontré que l’EGCG inhibait l’expression de gènes codant pour des facteurs de virulence de S. mutans, soit
atpD, eno, ldh et aguD (118).
Après avoir étudié la modulation de l’expression des gènes codant pour les facteurs de virulence majeurs de P. gingivalis, une analyse de la modulation du gène codant pour la protéine de résistance au stress HtrA a été réalisée. Nous avons déterminé que l’expression de ce gène est augmentée de manière dose-dépendante par l’extrait de thé vert et l’EGCG. Plus spécifiquement, l’expression du gène était environ 6 fois plus élevée que pour le contrôle lorsque la bactérie était en présence de 125 µg/ml de l’extrait de thé vert. Pour l’EGCG, un niveau d’expression 2.5 fois supérieur au contrôle a été observé à 62.5 µg/ml. Dans les résultats décrits précédemment, l’EGCG engendrait un effet généralement inférieur à celui obtenu avec l’extrait de thé vert, et ce, pour tous les gènes analysés. Le thé vert ayant démontré un meilleur effet, il semble logique d’observer un niveau de stress plus élevé chez la bactérie. D'après une analyse de la littérature, notre étude est la première à rapporter l’effet des polyphénols du thé vert sur l'expression de gènes codant pour la protéine HtrA. Toutefois, Kang et collaborateurs ont démontré que l’expression du gène
htrA chez S. mutans était augmentée lorsque la bactérie était placée en milieu acide (150).
Ils ont également démontré par l’utilisation d’un mutant déficient pour le gène htrA que la capacité de croissance de la bactérie était diminuée. Dans le même ordre d’idée, lors de l’étude d’un mutant de P. gingivalis déficient pour la protéine HtrA, il a été démontré que ce dernier était plus sensible au stress oxydatif que la souche sauvage (62). HtrA étant une
protéine de résistance au stress, l’augmentation de l’expression de son gène codant suggère que P. gingivalis est en situation de stress lorsque mise en présence des polyphénols du thé vert. Une étude réalisée chez P. aeruginosa a par ailleurs démontré que les polyphénols du thé vert peuvent induire un stress oxydatif chez cette bactérie. Cela a pour effet d’engendrer une augmentation de l’expression de plusieurs gènes liés au stress oxydatif comme katB,
sodM, ohr, lexA et recN (151).
Plusieurs études ont évalué l’effet du thé vert et de l’EGCG sur la croissance de P.
gingivalis et l’activité de certains de ses facteurs de virulence (124, 134, 140). Cependant,
aucune étude n’a été menée en regard de l’effet de ces composés sur l’expression de gènes chez P. gingivalis. Notre étude est donc la première à identifier le thé vert et l’EGCG comme étant des composés en mesure de diminuer de manière significative et dose- dépendante l’expression des gènes codant pour : les facteurs de colonisation (FimA, HagA et HagB), les facteurs impliqués dans la destruction tissulaire et l’inactivation des mécanismes de défense de l’hôte (RgpA et Kgp); et l’hémolysine chez cette bactérie. De plus, une augmentation de l’expression du gène codant pour la protéine de stress HtrA chez
P. gingivalis a été démontrée pour la première fois lors de cette étude. Des études à venir
permettront d’identifier les mécanismes impliqués dans l’inhibition des gènes à l’étude.
En conclusion, ce projet nous a permis de générer des données préliminaires permettant de supporter le potentiel préventif et thérapeutique du thé vert et de sa composante principale, soit l’EGCG. En effet, les résultats obtenus montrent que ce sont des composés antibactériens capables de diminuer l’expression des gènes codant pour les facteurs de virulence majeurs de P. gingivalis. Cette bactérie étant le principal agent étiologique de la parodontite chronique, les propriétés de ces produits pourraient s’avérer utiles en regard de la prévention et du traitement des maladies parodontales. Nos résultats ajoutent un nouvel aspect sur les modes d’action possibles des polyphénols du thé vert pour la santé parodontale. Plusieurs propriétés des polyphénols du thé vert sont déjà connus, par exemple leur effet anti-inflammatoire ou leur capacité à stimuler la production de -défensines par les cellules épithéliales (123). Des études chez le rat ont également démontré que les polyphénols du thé vert sont dotés de propriétés permettant de réduire la résorption osseuse
(119-121). Dans le même ordre, Yoshinaga et collaborateurs ont démontré qu’un extrait de thé vert était capable de diminuer la perte d’attache ainsi que le niveau de résorption osseuse chez le rat lorsque stimulé avec le LPS de E. coli (152). Un autre groupe de chercheurs a démontré que l’administration d’EGCG dans un modèle de parodontite chez le rat engendre une diminution de l’expression de l’IL-6 et du TNF ce qui a mené à une diminution de l’activité des ostéoclastes et donc une diminution de la destruction osseuse (153). Enfin, une étude dans un modèle murin a également permis de démontrer que les catéchines du thé vert sont en mesure d’inhiber la production d’IL-1, la résorption osseuse, ainsi que l’ostéoclastogenèse lors d’une parodontite induite par une injection de LPS de E. coli (154).
À l’heure actuelle, le thé vert est déjà utilisé comme additif dans divers produits d’hygiène buccale tels que le rince-bouche, le dentifrice et même la gomme à mâcher (Listerine natural green tea, Pepsodent et Mega-T). Cependant, aucune information précise relative à la quantité de thé vert et au pourcentage d’EGCG ni même relative à l’efficacité des composantes du thé vert une fois ajouté à ces produits ou aux interactions qu’elles pourraient avoir avec les autres molécules de ces produits n’est disponible ou même connue. Des études supplémentaires sont donc nécessaires pour s’assurer de l’efficacité des produits. À plus long terme, l’utilisation du thé vert et de l’EGCG à des fins de prévention ou de traitement des affections buccales pourrait être envisageable. L’introduction de ces composés naturels dans un gel, une fibre ou encore une bandelette pour une application locale comme il est actuellement possible de faire avec la tétracycline, le métronidazole et la chlorhexidine pourrait permettre un meilleur contact des parodontopathogènes avec les composés bioactifs (8, 122).
En perspective, bien que P. gingivalis soit un parodontopathogène important, il n’en demeure pas moins que T. denticola et T. forsythia sont deux autres agents pathogènes d’importance dans la parodontite chronique puisqu’elles sont également des membres du complexe rouge. Il serait donc justifié d’évaluer l’effet du thé vert et de l’EGCG sur l’expression des gènes codant pour leurs facteurs de virulence. Également, il pourrait s’avérer pertinent d’étudier l’effet des polyphénols du thé vert sur l’expression de la
leucotoxine, le facteur de virulence principal d’A. actinomycetemcomitans responsable de la forme agressive de la parodontite.