Le macrophage a un rôle primordial dans l’initiation et la résolution de l’inflammation. L’altération de ces fonctions est associée au développement ou à l’aggravation de plusieurs maladies inflammatoires ainsi qu’aux rejets de greffes.23,63,64 La voie du
CD200-CD200R est centrale pour la régulation de l’immunité et pour le contrôle de l’activation des cellules myéloïdes. Le CD200 a déjà été prouvé efficace comme traitement contre de multiples pathologies.45,50,65 À l’opposé, une faible expression
de CD200 est associée à plusieurs pathologies inflammatoires.52–54 Par contre, la majorité des modèles expérimentaux utilisent la souris où il est retrouvé quatre isoformes du récepteur du CD200 et qu’un des isoformes est activateur de l’inflammation au lieu d’être inhibiteur comme les autres isoformes.48 Cette variabilité
de fonction entre les isofomes du CD200R pourrait avoir un impact sur les conclusions de ces études. L’avantage d’un modèle expérimental chez le rat est qu’il comporte un seul isoforme du récepteur, soit le CD200R1, et que cet isoforme est le même que c’est l’humain.48 Cette étude est la première à explorer les impacts
d’une déficience en CD200 sur des BMDMs de rats qui a le même isoforme du CD200R que celui retrouvé chez l’humain. Il est connu dans la littérature que l’absence du CD200, chez la souris, engendre de l’inflammation. Par contre, il n’y a pas d’information sur les effets de l’absence du CD200 chez l’humain et peu chez le rat. Contre toute attente, l’absence de CD200 a diminué les fonctions inflammatoires des BMDMs de rat. Ces résultats sont associés à une diminution de la surexpression du TLR-4. La diminution d’expression du récepteur du LPS chez les rats déficients en CD200 pourrait expliquer en partie les résultats obtenus. Les résultats montrés dans cette étude indiquent qu’une activation du CD200R par son ligand pourrait aggraver l’inflammation lors d’une infection bactérienne. Les résultats ont aussi indiqué une implication du CD200 dans l’expression des molécules associées à la présentation d’antigène. De plus, les résultats ont montré une implication potentielle du CD200 dans la différentiation cellulaire. Ensemble, ces résultats indiquent que le CD200 aurait un rôle dans le développement et la sécrétion de cytokines chez les macrophages.
Les comptes cellulaires des BMDMs après culture ont montré que les cellules CD200 KO ont plus de difficulté à se différencier que les BMDMs WT. Ce résultat indique que le CD200 aurait une implication dans la différentiation cellulaire des cellules en culture. Le récepteur le plus impliqué lors de la différentiation est le GM- CSF. En effet, ce dernier est impliqué dans la différenciation, mais il est aussi réputé pour être stable et conservé au cours de la différenciation des BMDMs.66 Il a été
démontré que le récepteur conserve des niveaux d’expression similaire lors d’une différenciation, mais augmente lorsque stimulé au LPS chez la souris.67 De plus, son
expression est surtout contrôlée par des molécules associées à l’homéostasie cellulaire.66 Afin de confirmer que le récepteur du GM-CSF n’est pas impliqué dans
la difficulté de différenciations des BMDMs CD200 KO, il pourrait être mesuré par cytométrie de flux. Également, des protocoles de différenciations alternatifs pourraient être utilisés. Par contre, il serait peu probable qu’une absence en CD200 affecterait l’expression du GM-CSF. Dans plusieurs méthodologies de différenciation de BMDMs, le milieu de différenciation est supplémenté en IL-4 en plus du GM-CSF ou du M-CSF. Une autre méthode fréquemment utilisée est de mettre les cellules souches en contact avec du surnageant de L929 : une lignée cellulaire de fibroblastes murins qui sécrète plusieurs médiateurs chimiques, incluant des niveaux variables d’IL-4. Il est a noté aussi que les cellules souches lors de leur différenciation sécrètent elle-même des médiateurs afin de se stimuler de manière autocrine dans leur croissance. C’est pour cette raison qu’il est nécessaire de laisser les cellules en contact avec leurs milieux un maximum de temps. L’IL-4 est une cytokine qui est fortement impliquée dans le processus de prolifération.68,69
Une diminution de la prolifération des BMDMs CD200 KO pourrait être expliquée par une diminution d’IL-4 ou une déficience en son récepteur l’IL-4R. En effet, aucune étude n’a encore exploré l’hypothèse que l’absence en CD200 diminuait la sécrétion d’IL-4 ou bien l’expression de son récepteur. Par contre, dans un modèle de souris déficientes pour l’IL-4, il y a des niveaux plus faibles de CD200 sur des microglies
Dans cette étude, nous avons démontré pour la première fois que l’expression du CD200 lors de la différenciation des BMDMs augmente significativement, et encore d’avantage durant leur activation où presque la totalité des cellules expriment le CD200. L’expression du CD200 à la surface des BMDMs pourrait être un nouveau marqueur afin de caractériser la différenciation des macrophages. De plus, l’exposition à une endotoxine ou à un pathogène augmente l’expression du CD200 sur les cellules. Il avait déjà été montré à l’aide de Staphyloccocus aureus que plus l’infection était grave, plus l’expression du CD200 était forte.51 Le CD200 pourrait
devenir un nouveau marqueur indiquant des infections bactériennes.
En plus de l’expression du CD200 sur les BMDMs, l’expression de certaines molécules a été caractérisé afin d’étudier l’influence de l’absence du CD200 sur chacun de ces marqueurs lors de la différenciation. Le MHCII est un marqueur permettant d’identifier les BMDMs différentiés en plus d’être une molécule présentatrice d’antigènes. Son expression a été étudiée afin de confirmer l’identité des BMDMs et d’observer si l’absence du CD200 augmente l’expression du MHCII. En condition basale, après la différenciation environ la moitié des cellules expriment le MHCII. Il est documenté que les monocytes non différentiés expriment peu le MHCII et que les DCs expriment presque toutes le MHCII. Les macrophages, quant à eux, ont un profil intermédiaire d’expression du MHCII.71 Le SIRPα et le MHCII
sont les deux molécules qui caractérisent les macrophages. En condition sauvage, la presque totalité des BMDMs expriment le SIRPα, alors qu’au jour 6 peu de cellules l’exprimaient. Dans la littérature, les macrophages alvéolaires, par exemple, expriment tous le SIRPα, alors que les DCs sont plutôt caractérisées par un profil d’expression intermédiaire.71,72 À l’aide des résultats obtenus dans ce mémoire, il
est donc possible de confirmer que le protocole de différenciation utilisé dans ce mémoire produit des BMDMs puisque les BMDMs expriment en presque totalité le SIRPα et ont un profil intermédiaire d’expression du MHCII. Il est intéressant de noter que l’absence du CD200 réduit l’expression du MHCII et du SIRPα. Contrairement à l’hypothèse, l’absence du CD200 confère une incapacité des
BMDMs à exprimer le MHCII et expriment moins le SIRPα que les WT. Une plus faible expression de ces molécules pourrait être explicable par une mauvaise différenciation générale des BMDMs due à l’absence du CD200. Ensuite, l’expression du CD80 et du CD86 a été étudiée, car leur présence est nécessaire aux BMDMs pour aider à la présentation d’antigène et activer effectivement les lymphocytes T en cas d’infection. L’augmentation des molécules de costimulation qui a été observée chez les BMDMs, dans ce mémoire, est similaire à celle observée chez des monocytes dérivés de la moelle osseuse.73 Lors d’une absence en CD200,
l’expression du CD80 et du CD86 est moins augmentée lors de la différenciation comparativement aux WT. Cette découverte indique que le CD200 affecte l’expression des molécules de costimulation suggérant que le CD200 module l’expression des molécules de costimulation associées à la présentation d’antigènes. Ces résultats indiquent que sans CD200 les cellules auraient de la difficulté à se différencier correctement en macrophages et que les BMDMs auraient une défaillance basale à présenter des antigènes due principalement à l’absence de la molécule présentatrice d’antigènes ce qui prédisposerait les BMDMs à une défaillance pour l’activation inflammatoire.
Après avoir obtenu des BMDMs différenciés, les mêmes marqueurs ont été évalués, mais dans un contexte d’activation par exposition au LPS. Notre étude est la première démontrant que l’absence du CD200 diminue l’expression des marqueurs associés à la présentation d’antigènes lors d’une exposition au LPS. La forte sous expression basale des marqueurs de différenciation, soit le MHCII et le SIRPα, et l’incapacité des BMDMs CD200 KO à augmenter ces molécules lors d’une exposition au LPS suggère que les BMDMs CD200 KO ont une moins bonne faculté à répondre aux pathogènes et à activer les lymphocytes par la présentation d’antigènes. Ces résultats sont en opposition avec l’article de Ocaña-Guzman, R. et
al. qui décrit plutôt une augmentation de l’activation des cellules myéloïdes chez les
d’infection chronique alors que notre modèle consiste en une exposition aigüe au LPS. Il est possible que l’absence du CD200 n’ai pas le même effet dépendamment du moment de l’observation des effets. L’absence du CD200 au début d’une infection pourrait engendrer une réponse immédiate moins forte mais de plus longue durée comparativement aux WT. Donc, dans le cas d’une infection chronique, il serait possible de voir une plus grande inflammation chez les CD200 KO, car la résolution de l’inflammation est plus lente que chez les WT. De plus, l’absence du CD200 réduit l’expression du CD80 lors d’une exposition au LPS et aussi l’expression du CD86. Une récente étude a aussi obtenu une diminution de l’expression des molécules de costimulation.75 Leurs résultats s’expliquaient par une
augmentation de la phagocytose des microglies. Les microglies seraient davantage dans une phase de « nettoyage » plutôt que de signalisation lors de l’absence du CD200. Par contre, dans notre étude, les résultats d’essais de phagocytose n’ont montré aucune différence entre les groupes CD200 KO et WT, contrairement à ce qui a été rapporté par Lyons, A. et al.75 Dans leur étude, ils ont évalué la phagocytose
à l’aide de billes de polystyrènes au lieu de pathogène. 75 Les billes de polystyrènes
peuvent aussi servir à étudier l’endocytose, un sous-type de phagocytose qui est récepteur indépendant et internalise uniquement de petites particules.76 Ceci
pourrait expliquer la différence des résultats obtenus. Également, afin de confirmer nos résultats, il serait possible d’analyser l’intensité de phagocytose par les BMDMs par cytométrie de flux. Même si la sensibilité de détection de fluorescence du cytomètre en flux est sensiblement la même que le lecteur de plaque de fluorescence, utiliser cet appareil pourrait permettre une analyse cellule par cellule de la fluorescence des bactéries phagocytées. De plus, par cette analyse, il pourrait être observé la fluorescence des bactéries phagocytées uniquement chez les cellules vivantes et non-endommagées. En effet, il est possible d’ajouter un marqueur de viabilité ou d’apoptose qui discriminerait les cellules abimées et mortes des cellules vivantes. Aussi, la méthode au lecteur de plaque de fluorescence peut inclure des cellules mortes ou bien incapables de phagocyter dues à des dommages produits durant l’expérience ce qui amène des contaminations de signal de fluorescence à l’analyse de l’essai. La cytométrie en flux permettrait la discrimination
des cellules mortes et vivantes (marqueur de viabilité), donc un résultat plus réel de l’essai ce qui pourrait faire ressortir une différence entre les BMDMs CD200 KO et les BMDMs WT.
La sécrétion de cytokines est une fonction fondamentale des macrophages leur permettant de contrôler leur milieu. Dans cette étude, l’impact de l’absence du CD200 a donc été évalué sur la sécrétion de cytokines pro- et anti-inflammatoires après une stimulation LPS. Après une exposition au LPS, les BMDMs sécrètent moins d’IL-6 et TNF et aussi moins d’IL-10. Encore une fois, ces résultats sont contraires à l’étude de Snelgrove, R. J. et al. qui avait déjà documenté une augmentation de la sécrétion d’IL-6 et de TNF dans un contexte d’infection à l’influenza.77 La différence de résultats entre la présente étude et celle de Snelgrove
pourrait s’expliquer par le récepteur activé par l’infection. En effet, l’étude présente visait la stimulation du TLR-4 exclusivement alors que celle de Snelgrove visait surtout la stimulation du TLR-7.78 Il est possible que l’absence du CD200 n’ait pas
le même impact sur ce TLR. De plus, l’étude a été faite chez la souris qui comporte de multiples isoformes du CD200R ce qui aurait pu engendrer des variabilités. Donc, en plus d’être moins aptes à activer d’autres cellules immunitaires, les BMDMs CD200 KO ont aussi une déficience dans leurs fonctions sécrétoires. Cette diminution de sécrétion de cytokines engendrerait un ralentissement dans l’élimination des pathogènes.
Une piste explicative aux résultats est que l’absence de CD200 diminue la surexpression de TLR-4 ce qui pourrait affecter la réponse inflammatoire. Nos résultats démontrent que les BMDMs CD200 KO n’augmentent pas l’expression du TLR-4 suite à une stimulation au LPS comparativement aux cellules WT. Cette diminution d’expression de TLR-4 influencerait potentiellement la réponse générale
des BMDMs CD200 KO à répondre adéquatement à une infection. Toutefois, il existe deux types de LPS synthétisés par les bactéries gram négatives, une forme appelée « Smooth » et une seconde forme appelée « Rough ».79 La forme « Smooth
» est dépendante à l’activation de MyD88 alors que la forme « Rough » est indépendante de son activation.79,80 En effet, le LPS « Smooth » nécessite
l’implication de LPS-binding protein (LBP) et CD14 pour l’activation du TLR-4 alors que le LPS «Rough» active seulement le TLR-4.80,81 C’est deux sortes de LPS
engendrent une intensité et une rapidité de réponse différente chez les cellules inflammatoires. Pour notre part, le LPS utilisé contenait principalement de la forme « Smooth », donc l’implication du CD14 et du LBP. Il serait juste de vérifier l’expression de CD14 et LBP vu leur participation à l’activation de la réponse inflammatoire. Une plus faible expression de ces deux protéines adaptatrices jointes à la faible expression de TLR-4 pourrait de concert affecter fortement la réponse normale au LPS par les BMDMs CD200 KO. Ces résultats indiquent une nouvelle implication du CD200 pour la détection des pathogènes TLR-4 dépendant telles les bactéries Gram négative.
En résumé, les résultats de cette étude ont démontré de nouveaux impacts de l’absence du CD200 sur les BMDMs. L’absence du CD200 aurait un impact sur la prolifération et la différentiation des BMDMs. De plus, l’absence du CD200 cause une déficience de l’expression des molécules associées à la présentation d’antigène ce qui suggère un défaut dans le processus de présentation des antigènes. Dans le même lien, l’absence du CD200 diminue la sécrétion de cytokines pro- et anti- inflammatoires lors d’une exposition au LPS. Ces deux observations sont associées à une diminution de l’expression du TLR-4 en absence du CD200. Par ces résultats, il a pu être découvert un nouveau rôle pour le CD200. Ce dernier aurait une implication dans le bon développement des macrophages ainsi que dans la réponse aux pathogènes. De plus, le CD200 serait nécessaire pour la réponse inflammatoire des macrophages.