Instant evaluation of the absolute initial number of cDNA copies from a single real-time PCR curve
IV DISCUSSION GÉNÉRALE ET PERSPECTIVES
De nombreux modèles de tumeurs thyroïdiennes in vitro existent au laboratoire.
Des lignées cellulaires thyroïdiennes immortalisées provenant de tumeurs papillaires, folliculaires ou anaplasiques sont disponibles mais ont perdu toutes les caractéristiques de différenciation des cancers dont elles sont issues. Certaines d’entre elles ne présentent plus aucune caractéristique du tissu thyroïdien dont elles sont censées être issues. De plus, l’isolement de ces cellules par rapport à leur tissu environnant modifie fondamentalement les voies de signalisation intracellulaire. Ces modèles tumoraux in vitro se rapprochent dès lors nettement plus de tumeurs dédifférenciées que des tumeurs d’intérêt (87).
Les modèles de culture primaire de thyrocytes préparés directement à partir de tissu normal ou pathologique représentent une alternative aux lignées cellulaires. Ils se rapprochent plus d’un état physiologique et peuvent être soumis à différentes conditions expérimentales en incubant les thyrocytes dans des milieux de culture différents. Néanmoins, ces cultures ne peuvent être maintenues que pendant de courtes périodes, reflétant imparfaitement l’activation chronique des voies de signalisation retrouvées dans les différentes pathologies tumorales. L’étude du profil d’expression génique dans différentes conditions expérimentales a été réalisée au laboratoire (88-90). Les conditions de culture ne se rapprochent malheureusement qu’approximativement des conditions physiologiques, la pression partielle en oxygène, les concentrations en facteurs de croissances et les concentrations en sérum sont fortement différentes des conditions in vivo. L’isolement des thyrocytes des autres cellules environnantes (fibroblastes, cellules sanguines, cellules endothéliales) modifie très certainement l’expression de nombreux gènes au sein des thyrocytes. Les tranches thyroïdiennes sont une alternative aux cultures cellulaires. Elles présentent l’avantage de comporter en leur sein l’ensemble des cellules constitutives de la thyroïde à l’exception notable du compartiment sanguin. Elles respectent en partie l’architecture du tissu thyroïdien. Ces tranches ont été utilisées pour étudier différentes pathologies thyroïdiennes telles que les adénomes
mais il ne permettent pas de contrôler si le tissu étudié est bien homogène et si les tranches thyroïdiennes ne comprennent bien que le tissu d’intérêt (91).
Nous avons choisi d’utiliser des modèles de souris transgéniques de manière à nous rapprocher le plus possible des conditions pathologiques rencontrées chez l’être humain. Dans ces conditions, les modulations d’expression des gènes retrouvées représentent des variations intéressant aussi bien les thyrocytes que les fibroblastes, les cellules endothéliales, les cellules immunitaires… Nous avons identifié différents processus cellulaires régulés et nous avons élaboré des hypothèses physiologiques menant à la tumorigenèse, ceci dans des pathologies bénignes et dans des pathologies malignes. Nous avons également essayé de valider ces différents modèles en les comparant aux pathologies humaines correspondantes.
Dans la première partie de cette thèse, nous avons utilisé le modèle Tg-A2R qui parmi les modèles d’activation constitutive de la voie de l’AMPc au sein du thyrocyte, présente le phénotype le plus sévère. Notre modèle de souris Tg-A2R développent dans 100% des cas d’énormes goitres apparaissant dès le quinzième jour de l’embryogénèse, au moment où la thyroglobuline commence à être exprimée. Une hyperthyroïdie sévère menant au décès en l’absence de traitement est associé à cette hypertrophie thyroïdienne. Ce modèle, bien que présentant une thyroïde dont la croissance est majeure, présente une faible proportion de gènes modulés par rapport aux thyroïdes issues de souris contrôles. Ceci s’explique probablement par une différenciation conservée des thyrocytes, permettant une synthèse et une sécrétion non régulée d’hormones thyroïdiennes. Bien que notre modèle représente une activation constitutive de la voie de l’AMPc au sein des thyrocytes, l’ensemble des gènes modulés peut provenir aussi bien d’une activation directe de leur transcription par la voie de l’AMPc que d’une boucle de rétrocontrôle négative induite par celle-ci. Nous ne pouvons donc pas préjuger des mécanismes directs d’activation de la transcription de ces gènes, mais l’étude de l’expression globale des gènes réalisée sur une thyroïde in toto, nous donne une image complète de la régulation des gènes, secondaire à une activation spécifique de la voie de l’AMPc au sein des seuls thyrocytes, que ces gènes soient exprimés dans le thyrocyte ou dans d’autres types cellulaires. La croissance de la thyroïde n’est possible que si les thyrocytes prolifèrent, le tissu conjonctif offrant une base nécessaire aux vaisseaux permettant non seulement d’apporter les composants nécessaires au fonctionnement cellulaire, mais permettant également à la glande endocrine d’assumer sa fonction, en sécrétant des hormones dans la circulation sanguine.
Cette vision globale de l’expression génique dans la thyroïde in toto nous a permis d’émettre des hypothèses concernant le rôle de la modulation de la transcription de plusieurs gènes dont la fonction était connue et d’en inférer leur contribution à des pathologies entraînant un goitre ou un nodule hyperactif. La grande majorité des gènes modulés n’a jamais été décrite dans la thyroïde. Certains d’entre eux proviennent d’emblée de l’activation constitutive de la voie de l’AMPc, d’autres font partie de boucles de rétrocontrôle.
La mise en évidence d’une modulation de l’expression de l’IGF-1 et des IGFBP-3 et 5 nous permet de souligner in vivo le rôle autocrine et paracrine de ce facteur de croissance et de ses protéines porteuses. Le rôle de l’IGF-1 sécrété étant essentiel et bien démontré pour le thyrocyte, celui-ci étant moins évident pour les tissus environnants. Le thyrocyte devient une source de sécrétion des facteurs de croissance nécessaires au maintien de sa propre croissance et probablement de la croissance des tissus adjacents.
Les gènes impliqués dans le métabolisme cellulaire et le transport vésiculaire sont les plus modulés, ce qui se comprend aisément au vu de l’énorme goitre sécrétant de ces souris. Le thyrocyte pour assurer sa fonction doit en effet être à la fois différencié et capable de synthétiser des quantités d’acides nucléiques suffisantes pour assurer la prolifération cellulaire et la production d’ATP nécessaire au processus de sécrétion de grande quantité d’hormones thyroïdiennes. L’expression de différentes protéases nécessaires à l’hydrolyse de la thyroglobuline est augmentée dans notre modèle, soulignant la capacité accrue du système de production d’hormones thyroïdiennes après micropinocytose de la thyroglobuline.
La balance entre l’expression de gènes pro-apoptotiques et anti-apoptotiques se fait en faveur d’un profil plutôt anti-aptotique compatible avec la croissance continue de la thyroïde observée dans notre modèle de souris transgéniques.
La diminution de l’expression des gènes impliqués dans les phénomènes immunitaires et inflammatoires est à mettre en rapport avec l’absence complète d’infiltration par des cellules immunitaires des thyroïdes de nos souris. Le même phénomène s’observe dans les thyroïdes atteintes d’hyperthyroïdie familiale non-autoimmune.
l’expression de la caveolin-1 qui est une protéine structurelle importante de la membrane plasmatique, contribuant à la formation de microdomaines appelés caveolae. La caveolin-1 interagit avec de nombreuses molécules de signalisation telles que Gsα, la protéine kinase C et la Nitric oxide syhthase (NOS). La promotion de l’angiogénèse par la diminution de l’expression de la cavéolin-1 est une hypothèse séduisante, la régulation de l’expression de la cavéolin-1 se faisant en sens inverse de la production de radicaux libres, en particulier d’H2O2 (93).Néanmoins la production d’H2O2 au sein des nodules chauds et des tranches de tissus issus de patients souffrant d’hyperthyroïdie familiale non-auto-immune est diminuée, la régulation de l’expression de DUOX-2 ne dépendant pas de la voie de l’AMPc. D’autres générateurs de radicaux libres tels que NOX2 semblent être régulés par la voie de l’AMPc et pourraient jouer un rôle dans la régulation de l’expression de la Cavéolin-1.
Dans la deuxième partie de ce travail, essentiellement réalisée par Agnès Burniat, nous comparons deux modèles de pathologies tumorales malignes. L’un correspondant à un réarrangement identifié dans des variantes solides de carcinomes papillaires de la thyroïde (RET/PTC3) en pathologie humaine, l’autre ne correspondant à aucune pathologie thyroïdienne connue chez l’homme (E7). Bien que ces deux modèles développent des carcinomes bien différenciés, les mécanismes de tumorigenèse impliqués sont profondément différents. L’expression de gènes impliqués dans le cycle cellulaire est modifiée de façon majeure dans le modèle de souris E7, très faiblement contrebalancée par l’expression d’inhibiteurs des complexes cyclin-CDK. Les souris RET/PTC3 présentent quant à elles de nombreux mécanismes de rétrocontrôle inhibant l’activation de la voie des MAPK. Les mécanismes de rétrocontrôle différents peuvent facilement s’expliquer par le mode d’action de la protéine E7. En liant les protéines du groupe Rb (pRb), les facteurs E2F sont libérés permettant leur interaction avec les promoteurs de plusieurs gènes impliqués dans la progression du cycle cellulaire. Il n’est donc pas étonnant de voir une modulation majeure des protéines du cycle cellulaire dans ce modèle. La protéine de fusion RET/PTC3 agissant nettement plus en amont de la cascade de signalisation des MAPK, les boucles de rétrocontrôles ont tout le loisir de se mettre en place pour inhiber la progression du cycle cellulaire. Le croisement des souris RET/PTC3 avec des souris E7 donne un phénotype dominant de type E7 avec un développement tumoral qui n’est pas plus rapide que dans les lignées parentales (34).
Certains gènes impliqués dans les phénomènes immunitaires et inflammatoires sont régulés positivement dans ces deux types de tumeurs malignes. La signature inflammatoire des thyroïdes issues de souris RET/PTC3 est la plus intense dès leur jeune âge et s’amenuise avec le temps. Les souris E7 montrent une modulation plus tardive de cette réponse inflammatoire. Le programme
inflammatoire activé par ces deux oncogènes pourrait jouer un rôle majeure dans le processus d’oncogenèse, non pas en favorisant une réponse visant à éradiquer les cellules tumorales, mais au contraire en favorisant le processus d’oncogenèse par remodelage du tissu extracellulaire et stimulation de l’angiogenèse (94). Bien que les protéines RP3 et E7 présentent une immunogénicité forte, il est peu probable qu’elles soient responsables de la réponse immunitaire. Leur expression intracellulaire et surtout la tolérance immunitaire induite par l’expression, dès le 15ème jour de gestation, de ces protéines dans nos modèles exclue leur contribution en tant qu’antigène. La capacité d’induire une réponse inflammatoire innée et adaptative par RP3 a été démontrée indépendamment de son effet antigénique. La stimulation des cascades inflammatoires par les cascades de signalisation induites par RP3 favorise la mise en place d’un environnement favorable à la progression tumorale (95).
Les développements actuels rapides de thérapies ciblées dans de nombreux types de cancers épithéliaux présentant des mutations ou des réarrangements activant la voie des MAPK soulignent la nécessité de développer des modèles de pathologies tumorales humaines.
Les inhibiteurs de tyrosine kinase ayant une activité sur les réarrangements RET/PTC (96-102), les inhibiteurs de BRAF (103) et les inhibiteurs de MEK en sont quelques exemples avancés dans leurs phases de développement en oncologie (102;104). L’échappement aux traitements peut se développer dans le contexte de thérapies ciblées par plusieurs mécanismes. Soit des mutations de la cible thérapeutique apparaissent et empêchent la liaison de son inhibiteur (inhibiteur de tyrosine kinase, inhibiteur de BRAF), soit des modulations de l’expression des gènes impliqués dans les cascades de signalisation incriminée peuvent se produire. La technologie des microarrays, si elle ne permet pas de distinguer d’emblée les mutations empêchant les liaisons des inhibiteurs, permettrait de mettre en évidence ces éventuelles modulations telles que l’amplification de l’expression de cyclinD1 ou la diminution d’expression de PTEN.
De nombreux traitements immunomodulateurs sont également en développement dans la prise en charge des cancers. Certains inhibiteurs du CTLA4 semblent présenter une efficacité dans des pathologies agressives tels que le mélanome (105). Ceci pourrait paraître paradoxal en regard de la modulation intense des processus inflammatoires dans nos modèles tumoraux invasifs et du rôle
La comparaison de ces trois modèles nous permet de souligner différents aspects. Les souris étudiées ne montrent une variation d’expression génique en fonction de l’âge que dans notre modèle le plus agressif (RET/PTC3). Les souris adultes sauvages quant à elles ne montrent aucune variation de l’expression génique au niveau thyroïdien à 2, 6 et 10 mois. Il en est de même pour nos modèles tumoraux les plus homogènes histologiquement (A2R et E7) même si les souris E7 développent dans un nombre non négligeable de cas des pathologies tumorales invasives. La proportion faible de tissus non malins dans les thyroïdes issues de souris E7 peut expliquer cette stabilité d’expression génique, malgré l’apparition en général tardive de carcinome invasif dans ce modèle. Une étude de l’expression génique régionale par microdissection des zones histologiquement malignes comparées aux zones histologiquement bénignes nous permettrait probablement de montrer les variations géniques régionales nécessaires à l’acquisition d’un phénotype malin (106). Ceci permettrait de corréler cet apparent paradoxe d’une stabilité d’expression génique au cours du temps alors que des lésions morphologiquement malignes apparaissent. L’homogénéité histologique plus grande des souris A2R et des souris E7 pose moins ce problème de relevance des zones étudiées.
De façon intéressante, la régulation des gènes impliqués dans le processus immunologique se fait en sens inverse dans notre modèle bénin, comparé aux deux modèles de pathologies malignes. L’absence d’infiltration par des cellules inflammatoire dans notre modèle Tg-A2R est similaire à ce que l’on rencontre dans les thyroïdes de patients souffrant d’hyperthyroïdie familiale non auto-immune. La répression de gènes impliqués dans l’immunité pourrait favoriser la croissance tout en la maintenant dans les limites de la capsule thyroïdienne.
Les profils d’expression génique que nous avons réalisés sur nos modèles tumoraux de souris ne permettent pas de préjuger des régulations épigénétiques pouvant intervenir après transcription des ARN messager. Les régulations intervenant par l’intermédiaire d’ARN non codant (microRNA : miRNA) permettent d’inactiver de nombreux gènes pourtant transcrits. Un profil d’expression des miRNA exprimés dans nos modèles permettrait d’affiner le profil de nos tumeurs. Ces profils miRNA ont d’ailleurs été décrits comme moins lourds et plus précis que les profils microarrays basés sur l’expression des ARNm. (107-111)
La remise en question des idées habituellement admises dans les méthodes de quantification par PCR quantitative en temps réel nous a permis de mettre au point une méthode simple de quantification de la quantité absolue de cDNA initialement engagé dans la réaction.
Des courbes de calibration utilisant des plasmides portant le gène d’intérêt doivent être utilisées pour servir d’étalon à la quantification de cDNA engagé dans la réaction. Ces courbes ne présentent pas une fiabilité absolue, la quantité étalon d’ADN engagé dépendant de la mesure de la densité optique de l’échantillon. La détection d’éventuels ADN contaminants n’est pas possible par simple mesure de la densité optique et peut donc surestimer la quantité d’ADN du gène d’intérêt. La réalisation de ces courbes augmentent à la fois le temps requit et les coûts de la méthode.
De multiples obstacles peuvent se présenter lors de la comparaison de deux courbes d’amplification. Ces obstacles dépendent de la qualité de l’ARN purifié, de la présence d’éventuels inhibiteurs dans le milieu de réaction et de la présence potentielle d’ADN contaminant. La réalisation de courbes standards utilise des plasmides générés au laboratoire ou fournis commercialement et leur préparation peut fortement différer de la préparation issue directement des tissus d’intérêt.
La méthode que nous avons développée n’est valable que pour le Taqman, où les sondes sont hydrolysées lors de la phase de polymérisation de la PCR. Les autres méthodes gardent les sondes intactes.
La phase non exponentielle de la courbe de PCR ne peut s’expliquer que par une diminution de l’efficience de la réaction. Il en était déduit que le plateau ne pouvait être expliqué que par une inhibition complète de la DNA polymérase par ses produits d’amplification, d’autant plus que les méthodes tels que le FRET, les molecular Beacon et les scorpions atteignent également un plateau. Seule la phase d’amplification exponentielle était dès lors utilisée dans la quantification du produit initial.
Nous avons testé l’hypothèse la plus simple selon laquelle le plateau atteint lors de la réaction de PCR en temps réel par Taqman pouvait s’expliquer, dans des conditions expérimentales bien définies, par la consommation complète des sondes introduites dans la réaction. Nous avons pu démontrer qu’une seule courbe de PCR en temps-réel, correspondant à une seule condition expérimentale
V CONCLUSION
Nous avons lors de ce travail pu montrer l’utilité de différents modèles de pathologies tumorales thyroïdiennes et déterminer par une mesure d’expression génique globale la relevance de certains modèles par rapport aux pathologies humaines correspondantes. Alors que le modèle de pathologie bénigne (Tg-A2R) présente un profil d’expression stable au cours du temps, les thyroïdes de souris Tg-RET/PTC3 ne représentent que de manière transitoire un modèle de carcinome papillaire humain. La régulation de certains gènes dont la fonction était alors inconnue dans la thyroïde a été confirmée par différentes méthodes de PCR en temps réel. Nous avons été les premiers à développer une méthode permettant de quantifier l’ADN introduit dans la réaction sur base d’une seule courbe de PCR Taqman.
Les hypothèses soulevées mériteraient une validation quant à la fonction des gènes d’intérêts. Différentes méthodes d’inactivation in vivode l’expression des gènes existent et nous permettraient de confirmer les rôles potentiels de ces gènes dans la tumorigenèse thyroïdienne.
VI RÉFÉRENCES