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Université Libre de Bruxelles Faculté de Médecine Hôpital Erasme

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Academic year: 2021

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Université Libre de Bruxelles Faculté de Médecine

Hôpital Erasme

ETUDE DU PROFIL D’EXPRESSION GÉNIQUE DE PATHOLOGIES TUMORALES THYROÏDIENNES SE DÉVELOPPANT DANS DIFFÉRENTS MODÈLES DE SOURIS TRANSGÉNIQUES

Promoteur Prof. Bernard Corvilain

Dr Jean-Christophe Goffard

Unité de Traitements des Immunodéficiences Centre de Référence SIDA ULB-Erasme

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Résumé ... 4

Avant-Propos ... 5

I Introduction ... 6

La thyroïde normale ... 6

Introduction ... 6

Synthèse des hormones thyroïdiennes ... 7

Cascades de signalisations ... 7

Voie de l’AMPc ... 8

Voie des Inositols phosphates (IP)... 8

Voie des « Mitogen associated protein kinase » (MAPK) ... 9

Voie PI3K/Akt ... 9

Goitres thyroïdiens et modèles murins correspondants... 10

Goitre Diffus et multinodulaire ... 10

Souris Tg-E7 ... 10

Tumorigenèse thyroïdienne et modèles murins correspondants ... 11

Adénomes Folliculaires ... 12

Adénomes thyroïdiens autonomes – Nodules Chauds ... 13

Souris Tg-A2R ... 14

Adénomes folliculaires – Nodules Froids ... 15

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Carcinomes anaplasiques ... 18

Carcinomes peu différenciés ... 19

Méthode d’Analyses de l’expression génique de thyroïdes in toto. ... 20

Technologie des microarrays ... 20

PCR quantitative en temps réel ... 21

Agents intercalants ... 22

Sondes ... 22

Taqman ... 23

FRET ... 23

Molecular Beacon ... 24

Scorpions ... 24

II But du Travail ... 25

III Résultats ... 26

Profils d’expression génique des thyroïdes issues des souris transgéniques Tg-A2R ... 26

Profils d’expression génique des thyroïdes issues des souris transgéniques Tg-RET/PTC3 et E7 .... 47

Mise au point d’une méthode d’évaluation quantitative du nombre de copies de cDNA en se basant sur une seule courbe de PCR en temps réel ... 59

IV Discussion Générale et Perspectives ... 66

V Conclusion ... 73

VI Références ... 74

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RÉSUMÉ

Les tumeurs thyroïdiennes représentent les tumeurs endocrines les plus fréquentes. Parmi ces tumeurs les adénomes autonomes sont des tumeurs bénignes se développant secondairement à l’activation constitutive de la voie de l’AMPc. Cette activation est secondaire à des mutations somatiques survenant à différents niveaux de la cascade de signalisation induite par l’activation du récepteur TSH. La pathologie thyroïdienne maligne est essentiellement représentée par les carcinomes papillaires de la thyroïde pour lesquelles de nombreuses modifications génétiques ont été décrites, les plus fréquentes étant les réarrangements impliquant la tyrosine kinase Ret. Différents modèles de souris transgéniques ont été développés et représentent d’excellents outils pour étudier in vivo l’expression génique secondaire aux mutations initiales. Nous avons choisis d’utiliser la technologie des microarrays pour analyser simultanément l’expression de milliers de gènes dans différents modèles de souris transgéniques développant des pathologies thyroïdiennes bénignes et malignes . Au cours de cette thèse de doctorat, nous avons déterminé à l’aide de microarrays le profil d’expression génique de souris exprimant à la surface des cellules thyroïdiennes de manière spécifique le récepteur A2a de l’adénosine, ce qui mène à l’activation constitutive de la voie de l’AMPc et au développement d’une hyperthyroïdie sévère associée à un énorme goitre. Cette étude nous a permis d’identifier des gènes dont le rôle potentiel dans le développement de tumeur bénigne était jusqu’à lors inconnu. Nous avons également comparé deux modèles murins développant des tumeurs malignes de la thyroïde. D’une part les souris exprimant le réarrangement Ret/PTC3, très commun dans les carcinomes papillaires de la thyroïdes issus de la première vague de cancer survenu après la catastrophe de Chernobyl, d’autre part les souris exprimant l’oncoprotéine E7 dérivée de l’HPV16 responsable du cancer du col de l’utérus. Les différences et les similarités entre ces deux lignées et différentes pathologie humaine ont été décrites.

La PCR quantitative en temps réel a été utilisé pour confirmer et quantifier la différence d’expression des gènes d’intérêts entre les thyroïdes de souris contrôles de même souche et les thyroïdes issues de souris transgéniques. La PCR en temps réel permet de monitorer à l’aide d’un signal fluorescent émis lors de l’hydrolyse d’une sonde, la quantité d’amplicons produite dans la réaction. La courbe d’amplification se caractérise par une phase exponentielle, suivie par une phase non exponentielle se terminant par un plateau.

Contrairement aux idées reçues, nous avons pu démontrer que le plateau était expliqué par la déplétion de la sonde hydrolysée par la Taq polymérase lors de la réaction d’amplification. Dès lors que l’hydrolyse de la sonde reflète quantitativement la synthèse d’amplicons, la fluorescence produite dans la phase exponentielle de la réaction reflète la concentration des amplicons produits. Nous avons donc, sur base de ces observations pu

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AVANT-PROPOS

Je tiens tous particulièrement à remercier Bernard Corvilain pour son soutien sans faille, sa bonne humeur et son sens unique des relations humaines. Confiant et optimiste, il m’a permis de finalement réaliser cette thèse de doctorat malgré les sollicitations cliniques incessantes.

Françoise Miot qui a supporté les sonneries infernales de mon bip dans une pièce de 6 m², tout en gardant le sourire, elle partageait son goût de la recherche. Sa gentillesse ajoutée à son regard scientifique permet à chacun de progresser.

J’ai eu la chance de croiser Jacques Dumont dès mon premier doctorat. Personnage aux vues tranchées, à l’enthousiasme inébranlable, il m’a permis de découvrir l’IRIBHM avec ces « bébés » chercheurs, ces doctorants et tous ces « grands » chercheurs que je pensais inaccessibles, mais dont la porte était toujours ouverte.

L’humanisme modeste de Gilbert Vassart force l’admiration de chaque doctorant passant à l’IRIBHM.

Agnès, Natacha, Ling, Hortensia, Vincent, Laurent, Alban, Hakim, Bernadette …. et tous ceux que je n’oublie que sur le papier ont permis à un simple clinicien de passer des moments inoubliables dans un laboratoire de recherche exceptionnel.

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I INTRODUCTION

LA THYROÏDE NORMALE

INTRODUCTION

La thyroïde est une glande endocrine située chez l’homme dans la partie antérieure et inférieure du cou, en avant des premiers anneaux de la trachée et des parties latérales du larynx. Une thyroïde normale pèse entre 10 et 28 grammes. Les deux lobes thyroïdiens mesurent chacun 6 centimètres de hauteur et sont réunis par un isthme passant devant les deuxième, troisième et quatrième anneaux trachéaux. Les unités fonctionnelles de la thyroïde sont les follicules thyroïdiens. Il s’agit de structures sphériques bordées d’une seule couche de cellules épithéliales cubiques, les cellules folliculaires, limitées par une membrane basale. Les follicules sont de taille variable et contiennent un matériel éosinophile homogène appelé colloïde. La thyroïde est entourée par une capsule externe de tissu conjonctif lâche et par une capsule interne fibro-élastique. De la capsule interne partent des septa qui divisent la glande en lobules. Ces septa sont le support de la vascularisation sanguine, des lymphatiques et des nerfs. La taille de chaque follicule est le reflet de son activité de synthèse ou d’excrétion.

Le principal constituant de la colloïde correspond à la thyroglobuline. Cette glycoprotéine est le précurseur des hormones thyroïdiennes, à savoir l’hormone active, la tri-iodothyronine (T3) et une hormone inactive en tant que telle, la thyroxine (T4), elle-même pouvant être métabolisée en T3 active ou en rT3 également inactive.

Le contrôle de la fonction thyroïdienne et de sa croissance sont principalement régulés par la TSH (thyrotropine) produite par l’hypophyse en réponse à la sécrétion hypothalamique de la TRH

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SYNTHÈSE DES HORMONES THYROÏDIENNES

La synthèse des hormones thyroïdiennes nécessite une captation de l’iodure du sang circulant par les thyrocytes au niveau de leur membrane baso-latérale. Cette captation est possible grâce à l’utilisation d’un symporteur Na+ /I- (NIS) permettant l’entrée de l’iodure dans le cytoplasme de la cellule (1;2). Pour atteindre la lumière folliculaire, l’iodure passe au travers de la membrane apicale par transport passif. Deux candidats potentiels ont actuellement été identifiés mais leur fonction de transporteur d’iodure reste encore controversée. Il s’agit de la pendrine, codée par le gène Slc26a4, dont certaines mutations entraînent le syndrome de Pendred associant une surdité et un goitre le plus souvent euthyroïdien (3;4). L’AIT (Apical Iodide Transporter, gène Slc5a8) est un autre candidat permettant le transport de l’iode vers la lumière folliculaire (5).

Une fois dans la lumière folliculaire l’iodure est couplé à la thyroglobuline présente en grande quantité dans la lumière des follicules. L’iodure est d’abord oxydé au niveau de la membrane apicale en présence d’H2O2, grâce à l’action de la thyroperoxidase (TPO). L’ H2O2 est quant à lui produit par deux NADPH oxydase (DUOX1 et DUOX2). Une fois oxydé, l’iode se fixe sur les résidus tyrosines de la thyroglobuline et forme des dérivés monoiodés et diiodés. Le couplage des différents résidus entre eux est catalysé par la TPO et permet de former les hormones T3 et T4 (6;7).

La thyroglobuline ainsi chargée d’hormones T3 et T4 est endocytée par les thyrocytes. L’endosome rempli de thyroglobuline fusionne ensuite avec les lysosomes ce qui permet le clivage de la thyroglobuline et la libération des hormones T3 et T4 qui sont alors sécrétées dans la circulation sanguine. (Figure 1)

CASCADES DE SIGNALISATIONS

Quatre cascades principales sont impliquées dans la régulation de la fonction thyroïdienne, de sa croissance et de sa différenciation. La cascade de l’AMPc, la cascade des inositols phosphates, la cascade des MAPK et la cascade des PI3K. Chacune de ces voies peut être stimulée par des signaux extracellulaires tels que des hormones, des facteurs de croissance ou des neurotransmetteurs entraînant par leur action sur différents récepteurs spécifiques une activation ou une répression de l’expression de différents gènes.

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VOIE DE L’AMPC

La voie de l’AMPc stimule la prolifération et la différenciation des thyrocytes(8). Cette voie de signalisation est activée par la TSH. Le récepteur à la TSH est un récepteur à sept hélices transmembranaires permettant en présence de son ligand de remplacer le GDP lié à la sous-unité α de la protéine Gs par du GTP. La protéine Gsα active alors l’adénylate cyclase qui catalyse la transformation d’ATP en AMPc. Tout autre agent permettant d’activer la signalisation en aval du récepteur TSH, que ce soit dans des conditions expérimentales (forskoline activant l’adénylate cyclase, toxine cholérique activant la protéine Gs, analogues de l’AMPc (9)) ou par mutation activatrice des protéines en aval du récepteurs TSH entraîne l’activation de la cascade.

L’augmentation de la concentration intracellulaire d’AMPc permet la libération de la sous unité catalytique de la protéine kinase A de sa sous unité régulatrice liant l’AMPc. Dans le noyau cellulaire, la PKA phosphoryle différentes protéines nucléaires spécifiques.

Par ce biais, la TSH induit l’expression de gènes de différenciation spécifiques de la thyroïde tels que la thyroglobuline, la TPO, NIS, DUOX1, DUOX2 et le récepteur TSH lui-même. Trois facteurs de transcription jouent un rôle essentiel dans l’activation de ces gènes spécifiques de la thyroïde : Pax8, TTF1 et TTF2 (10-13).

L’effet mitogénique de la TSH ne peut par contre s’exercer seul, celui-ci nécessite la présence d’insuline ou l’IGF-1 dans des conditions de cultures cellulaires (14-16). (Figure 2)

VOIE DES INOSITOLS PHOSPHATES (IP)

La voie des IP est également activée par la liaison de la TSH à son récepteur. La concentration en TSH nécessaire à l’activation de la voie des IP est dix fois supérieure à celle activant la voie de l’AMPc. La voie des IP entraîne également la prolifération des thyrocytes mais inhibe leur différenciation.

La TSH à haute concentration stimule la phospholipase C (PLC) par l’intermédiaire de la protéine Gq.

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VOIE DES « MITOGEN ASSOCIATED PROTEIN KINASE » (MAPK)

La voie des MAPK est utilisée par tous les types cellulaires dans les phénomènes de prolifération, d’apoptose, de migration et de développement.

Les facteurs de croissance tels que l’EGF et l’HGF induisent la prolifération mais inhibent la différenciation des thyrocytes. L’effet mitogène de l’EGF nécessite, comme pour la TSH, la présence d’insuline ou d’IGF-1 (9;21). L’IGF-1 ou l’insuline ne sont par contre pas nécessaires lorsque l’HGF exerce son effet mitogène (14;22;23).

Les facteurs de croissance se lient à des récepteurs de types tyrosine kinase induisant leur dimérisation et leur autophosphorylation sur des résidus tyrosine. Cette phosphorylation permet le recrutement de protéines adaptatrices telles que Grb-2-Sos activant la protéine Ras par remplacement du GDP par du GTP(24;25). Ras permet de recruter et d’activer la serine-thréonine kinase Raf en la positionnant à proximité de la membrane. Raf phosphoryle ensuite les MAPKK (MEK) qui en cascade phosphoryle les MAPK (ERK1/2) qui migrent dans le noyau pour activer les facteurs de transcription spécifiques tels que Elk-1, c-Jun et ATF-2 (26). (Figure 2 et 3)

VOIE PI3K/AKT

La liaison de facteurs de croissance à leurs récepteurs ayant une activité tyrosine kinase permet d’activer la PI3K, directement ou par l’intermédiaire de Ras.

La PI3K activée permet de convertir le PIP2 en PIP3 (phosphatidylinositol 4,5-triphosphate). Le PIP3 recrute la protéine kinase B (PKB ou Akt) qui une fois activée phosphoryle différents substrats. Cette cascade est régulée entre autres par une phosphatase (PTEN) permettant de déphosphoryler le PIP3 en PIP2.

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GOITRES THYROÏDIENS ET MODÈLES MURINS CORRESPONDANTS

GOITRE DIFFUS ET MULTINODULAIRE

Les goitres diffus entreprennent de façon homogène l’ensemble de la thyroïde et sont le plus souvent liés à une anomalie de synthèse des hormones thyroïdiennes. L’augmentation de volume de la thyroïde est en général peu importante, l’histologie de la glande démontre une certaine hétérogénité avec d’énormes follicules distendus coexistant avec de petits follicules. Les goitres multinodulaires correspondent à une succession d’épisodes d’hyperplasie et d’involution d’un goitre diffus menant à une augmentation de taille de la thyroïde qui présente une forme irrégulière.

Virtuellement tous les goitres diffus évoluent vers un certain degré de multinodularité avec le temps.

Les goitres multinodulaires se présentent cliniquement par une augmentation de volume thyroïdien parfois extrême prise à tord pour une atteinte néoplasique thyroïdienne. Certains nodules peuvent apparaître au sein d’un goitre multinodulaire et peuvent être en tous points semblables aux nodules chauds décrits ultérieurement, à la fois par l’aspect histologique et par les mutations activatrices du récepteur TSH que l’on y retrouvent (27). Ces mutations mènent à une activation constitutive de la voie de l’AMPc et peuvent être différentes d’une zone à l’autre au sein d’un même goitre. A côté de ces nodules chauds peuvent coexister des nodules froids correspondant à des nodules colloides simples.

L’association entre un tabagisme actif et une augmentation du volume thyroïdien ou la présence d’un goitre multinodulaire a été démontrée dans les régions ayant une carence iodée importante (<50 µg/j) (28). Une association entre la consommation d’alcool, même modérée, et le volume thyroïdien est également notée indépendamment du régime iodé (29).

SOURIS TG-E7

L’utilisation du promoteur de la thyroglobuline pour entraîner une expression spécifique dans la

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promoteurs qui peuvent alors moduler la transcription de plusieurs gènes importants pour la progression du cycle cellulaire (DHFR, c-myc, B-myb, and cyclin A) (31). E7 empêche également les inhibiteurs des kinases dépendantes des cyclines (CKI) p21 et p27 d’inhiber le complexe cyclineE/cdk2 ce qui entraîne la progression de la phase G1 à la phase S. L’expression de la protéine E7 dans les thyrocytes permet donc une croissance continue affectant peu la différenciation de ceux- ci. D’un point de vue morphologique, ces souris développent dès l’âge d’un mois un énorme goitre se caractérisant par des zones hyperplasiques où les cellules folliculaires deviennent de plus en plus nombreuses, se chevauchant et formant des structures « en palissades ». Des papilles se projetant à l’intérieur de follicules se développent. Vers l’âge de 6 mois, ces structures « en palissades » en bordure des follicules coexistent avec d’énormes follicules bordés par des cellules folliculaires aplaties (32). Certaines études histologiques démontrent l’apparition de tumeurs malignes thyroïdiennes chez près de 15% des animaux. D’autres études ne démontrent aucun développement tumoral malin (33;34).

Les cellules thyroïdiennes de ces souris démontrent dans un premier temps une capacité élevée à lier l’iode mais qui finit par disparaître dans les follicules bordés par des cellules aplaties où l’expression de NIS s’amenuise. La capacité de prolifération mesurée par le marquage du Ki-67 ou par l’incorporation de BrdU est la plus élevée à l’âge de deux mois et est alors distribuée de façon homogène. A l’âge de 6 mois de rares foyers de prolifération persistent au sein de petits follicules de forme irrégulière.

TUMORIGENÈSE THYROÏDIENNE ET MODÈLES MURINS CORRESPONDANTS

Les tumeurs thyroïdiennes représentent les tumeurs endocrines les plus fréquentes. Dans les pays présentant une relative carence dans les apports iodés, un dépistage par échographie d’une population non sélectionnée démontre la présence d’un goitre ou d’un nodule thyroïdien de plus de 0,5 cm dans près de 33% de la population active (35). La plupart de ces nodules thyroïdiens passent inaperçus lors d’un examen clinique. Ces nodules sont très majoritairement bénins (36) et touchent principalement les femmes. Malgré leur caractère le plus souvent bénin, ces pathologies tumorales ont un impact clinique important tant en terme de morbidité par les pathologies qu’elles peuvent induire (dysfonction thyroïdienne, obstruction mécanique, potentielle pathologie maligne) qu’en terme de coût pour la sécurité sociale dû aux examens nécessaires à l’exclusion d’une pathologie maligne et au suivi de ces patients.

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Le cancer thyroïdien quant à lui représente à l’heure actuelle le 7ème cancer le plus fréquent chez la femme. L’évolution de l’incidence ajustée pour le sexe et l’âge montre une augmentation de fréquence beaucoup plus importante que pour tout autre cancer ces dernières années (37).

Une tumeur thyroïdienne se développe lorsqu’une cellule thyroïdienne échappe au mécanisme de contrôle régulant la division cellulaire. Ceci confère à cette cellule un avantage sélectif menant à une croissance accrue, incontrôlée, entraînant la formation de masses tumorales.

Comprendre les modifications génétiques menant au développement tumoral permettrait de comprendre les différentes caractéristiques cliniques des pathologies tumorales thyroïdiennes. Les anomalies génétiques résultent le plus souvent de mutations somatiques apparaissant dans une cellule thyroïdienne et mènent au développement clonal de masses tumorales, expliquant le caractère sporadique de ces pathologies. Certaines tumeurs thyroïdiennes beaucoup plus rares résultent de mutations germinales et sont transmises de manière familiale (38).

L’Organisation Mondiale de la Santé à revu en 2004 la classification des tumeurs thyroïdiennes et distingue les types de tumeurs suivantes :

• Adénomes folliculaires et autre tumeurs bénignes

• Carcinome Papillaire de la thyroïde

• Carcinome folliculaire

• Carcinome peu différencié

• Carcinomes indifférencié ou anaplasique

• Carcinome médullaire

• Autres (tumeurs épithéliales, lymphome…)

La classification de l’OMS est actuellement le standard utilisé pour la classification histologique des tumeurs thyroïdiennes. Elle souffre malheureusement d’une variabilité inter et intra observateur importante(39).

ADÉNOMES FOLLICULAIRES

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Les caractéristiques histologiques des tumeurs bénignes sont également reprises dans la classification de l’OMS. Les adénomes thyroïdiens se distinguent par leur fonctionnalité :

• Adénome folliculaire

o Adénomes thyroïdiens autonomes, (hypercaptants, Nodules chauds, Adénomes toxiques)

o Adénomes thyroïdiens hypocaptants - Nodules froids

Bien que classé dans les adénomes folliculaires, la pathogénie et l’histoire clinique des adénomes thyroïdiens autonomes est totalement différentes des autres tumeurs bénignes de la thyroïde. Des modèles de souris transgéniques ont été développés au laboratoire et présente des caractéristiques les rapprochant des adénomes thyroïdiens autonomes. Il n’existe malheureusement pas de modèles de souris transgéniques développant des adénomes folliculaires n’étant pas hypercaptant à la scintigraphie.

ADÉNOMES THYROÏDIENS AUTONOMES – NODULES CHAUDS

Les adénomes thyroïdiens autonomes sont des tumeurs thyroïdiennes bénignes capables de produire et de sécréter des hormones thyroïdiennes indépendamment du contrôle hypophysaire. Ils se présentent sous forme de nodules isolés fixant l’iode de façon plus importante que le tissu thyroïdien normal. Lors d’un examen isotopique, ces nodules sont dit « chauds » pour cette raison. Ils peuvent entraîner une hyperthyroïdie.

La majorité de ces adénomes thyroïdiens autonomes sont secondaires à des mutations somatiques apparaissant dans deux gènes codant pour les protéines impliquées dans la cascade de signalisation de la thyrotropine (TSH) ; le récepteur TSH et la protéine G(Figure 2). La TSH sécrétée par l’hypophyse se lie normalement à son récepteur exprimé à la surface des cellules folliculaires thyroïdiennes et entraîne un changement conformationel de celui-ci permettant son activation. Ce changement de conformation entraîne l’activation de la voie de l’AMPc. L’AMPc est le second messager principal de la thyroïde, il stimule sa croissance ainsi que la différenciation et la fonction des cellules folliculaires thyroïdiennes.

Plus de 50 mutations activatrices du récepteur TSH ont été décrites dans différentes régions du récepteur (40;41). Le plus souvent ces mutations entraînent une activation constitutive de la voie de l’AMPc mais pas de la voie de l’inositol triphosphate (IP3) (42;43). De rares cas de mutations germinales activatrices du récepteur TSH ont été décrits dans différentes familles souffrant d’hyperthyroïdie familiale non auto-immune (44;45). Dans ces cas, l’hyperthyroïdie peut se

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manifester dès la naissance et est caractérisée par le développement d’un énorme goitre. Des cas d’hyperthyroïdie congénitale sporadique existent également et se caractérisent par l’apparition de mutations au cours de l’embryogénèse, où l’individu présente un mosaïcisme cellulaire : les mutations activatrices du récepteur TSH se retrouvant dans les thyrocytes mais ne sont pas retrouvées dans d’autres cellules de l’organisme.

Des mutations entraînant l’apparition d’une arginine en position 201 ou d’une glutamine en position 225 de la sous unité α de la protéine G ont le même effet que les mutations activatrices du récepteur TSH. Ces mutations diminuent la capacité d’hydrolyse du GTP, rendant le complexe Gsα-GTP plus stable et menant à une activation constitutive de la voie de l’AMPc. Contrairement aux mutations du récepteur TSH, ces mutations n’ont pas été retrouvées dans la lignée germinale. Les mutations surviennent au cours de l’embryogenèse et entraînent des syndromes différents dépendant des tissus touchés. Celles-ci peuvent entraîner des adénomes somatotropes lorsque elles apparaissent dans l’hypophyse ou au syndrome de McCune-Albrigth lorsque elles surviennent plus précocement au cours de l’embryogenèse (46;47).

SOURIS TG-A2R

Les souris Tg-A2R représentent un excellent modèle in vivo d’activation constitutive de la voie de l’AMPc, proche de l’hyperthyroïdie familiale non auto-immune. Ces souris ont été générées en construisant un gène de fusion comprenant le promoteur bovin du gène de la thyroglobuline lié par l’intron II de la béta globine bovine à la région codante du récepteur A2 à l’adénosine d’origine canine (48).

Le promoteur bovin de la thyroglobuline permet une expression spécifique du transgène au niveau des cellules folliculaires de la thyroïde. Le récepteur A2 à l’adénosine est activé constitutivement par le relargage continu d’adénosine dans le milieu interstitiel, et entraîne par couplage à la protéine Gs une activation constitutive de la voie de l’AMPc (49-51)

Le phénotype de ces souris se caractérise par une augmentation du fonctionnement et de la croissance de la glande thyroïde, avec une différenciation conservée des cellules folliculaires.

Ces souris décèdent de façon prématurée entre 5 et 9 mois de vie suite à une hyperthyroïdie sévère

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d’iode au sein des thyroïdes des souris transgéniques augmente dans les mêmes proportions qu’augmentent le taux d’hormones thyroïdiennes.

La croissance des thyroïdes des souris Tg-A2R, investiguée par l’incorporation de BrdU lors de la phase S est, dès les premiers 15 jours de vie, plus importantes que chez les souris contrôles du même âge. Plus tard, alors que la croissance des thyroïdes normales s’arrête celle des thyroïdes Tg- A2R se poursuit au même rythme.

L’étude morphologique de ces thyroïdes est corrélée à la prolifération constante des cellules thyroïdiennes. Les thyroïdes ont un aspect histologique normal à la naissance mais développent dès l’âge d’un mois des projections papillaires au sein de la lumière folliculaire, signant la prolifération accrue des thyrocytes. La glande continue à croître pour atteindre à l’âge de 9 mois un poids de 400 mg contre 3 mg pour des thyroïdes normales provenant de souris du même âge. De nombreuses mitoses sont visibles dans les thyroïdes de souris Tg-A2R alors que celles-ci sont virtuellement absentes dans des thyroïdes normales. La stimulation chronique de la croissance thyroïdienne ne mène néanmoins pas à la formation de cancer dans ce modèle.

Ces souris permettent d’étudier in vivo le rôle de la cascade de l’AMPc dans la prolifération cellulaire.

Contrairement au modèle de culture in vitro l’activation constitutive de la voie de l’AMPc dans ce modèle murin se fait sur une très longue période, rejoignant ce qui se passe dans l’hyperthyroïdie familiale non auto-immune (52). Ces souris représentent également un excellent modèle de la maladie de Grave-Basedow, nettement plus fréquente, où l’activation du récepteur TSH est médiée par des auto-anticorps activant le récepteur à la TSH de manière chronique (53).

ADÉNOMES FOLLICULAIRES – NODULES FROIDS

Les adénomes folliculaires ou nodules froids contrairement aux adénomes autonomes présentent une diminution de la captation d’iode lors d’examens scintigraphiques. 5% des adénomes folliculaires se révèlent être des carcinomes folliculaires (54). Les déterminants moléculaires menant au développement d’adénomes folliculaires sont nettement moins bien caractérisés que ceux des adénomes autonomes. La distinction entre les adénomes folliculaires et les carcinomes folliculaires est particulièrement difficile en clinique car il n’existe aucun critère unique, morphologique ou cellulaire, permettant un diagnostic de certitude (55). Souvent l’aspiration à l’aiguille fine ne suffit pas à établir un diagnostic formel et seule l’histologie de la pièce de résection permet un diagnostic définitif. L’implication d’une dysrégulation de la voie de signalisation PI3/Akt est décrite dans 31%

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des adénomes folliculaires (56). Des mutations impliquant RAS ou des réarrangements impliquant Pax8 et PPARγ sont autant associés aux carcinomes folliculaires qu’aux adénomes folliculaires.

TUMEURS MALIGNES

CARCINOMES PAPILLAIRES

Les carcinomes papillaires de la thyroïde (PTC) représentent plus de 80 % des cancers thyroïdiens. Ils sont en général de bon pronostic et sont divisés en nombreux sous-types dont les plus fréquents sont:

• Papillaire classique

• Variante folliculaire

• Microcarcinomes papillaires

Les mutations menant au développement de ces cancers sont connues et entraînent l’activation de la voie des MAPK. L’activation de la voie des MAPK peut se faire directement par une mutation activatrice de BRAF ou plus rarement de RAS, ou indirectement par des réarrangements impliquant des récepteurs à activité tyrosine kinase (TRK, RET/PTC), ou impliquant BRAF (Akap9/BRAF) (57). Les réarrangements RET/PTC sont retrouvés dans 20 à 70% des carcinomes papillaires sporadiques et dans plus de 70 % de carcinomes papillaires induits par les radiations chez les enfants atteints (58- 63).

Les mutations de BRAF entraînent une activation constitutive de cette sérine/thréonine kinase importante dans la voie de signalisation des MAPK (64). La mutation de BRAF la plus fréquemment rencontrée dans les PTC entraîne le remplacement d’une valine par un glutamate en position 600 (V600E) aussi bien dans la thyroïde que dans d’autres cancers épithéliaux tels que le mélanome. Les réarrangements RET/PTC résultent de la fusion du domaine tyrosine kinase du gène RET, normalement non exprimé dans les thyrocytes, avec la partie 5’ d’un gène exprimé dans la thyroïde

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récepteur au NGF normalement absent dans les cellules folliculaires, se font avec un gène ubiquitaire entraînant également une activation constitutive de la voie des MAPK.

SOURIS TG-RET/PTC3

Ces souris ont été générées en plaçant sous la dépendance du promoteur de la thyroglobuline bovine le cDNA codant pour la protéine de fusion RET/PTC3 (RP3). Le réarrangement menant à la formation de ce gène RET/PTC3 résulte d’une fusion entre l’extrémité 5’ du gène ELE1 et le proto-oncogène RET. ELE1 code pour un co-activateur des récepteurs aux androgènes et possède un domaine de dimérisation nécessaire à l’activation de RET (66).

Dès l’âge de 2 mois, les souris présentent une augmentation de volume de leur thyroïde (quatre fois plus grandes que les thyroïdes issues de souris contrôles). Elles restent néanmoins plus petites que les thyroïdes issues de souris E7 du même âge. L’hypertrophie glandulaire est en grande partie due à une hyperplasie cellulaire se caractérisant par de larges papilles se projetant dans les follicules. Cette architecture est progressivement remplacée par un pattern cribriforme difficile à distinguer d’un processus tumoral diffus. Dans 28% des thyroïdes Ret/PTC3, les follicules thyroïdiens sont remplacés par une série de larges kystes remplis de structures papillaires plus ou moins coalescentes, bordées de larges cellules. Un mélange de tissus mésenchymateux et de feuillets cellulaires bordés par des cellules rondes ou en fuseaux bordent les kystes ainsi formés. Ce pattern devient rare à l’âge de 6 mois et totalement absent à l’âge de 10 mois. Dans près de 50 % des thyroïdes de souris de plus de 6 mois, de larges kystes bordées par une structure discrètement micropapillaire se développent dans une thyroïde quasiment normale ou modérément hyperplasique.(33)

Les souris transgéniques exprimant RP3 dans leur thyroïde développent un véritable carcinome papillaire dans 15 à 55% des cas après un an (33;34;66). Ces tumeurs sont parfois microscopiques, parfois macroscopiques. Elles peuvent être uniques ou multiples, mais sont souvent mal circonscrites. Le type prédominant est une variante solide de carcinome papillaire sans structure folliculaire ou papillaire évidente. Les cellules possèdent soit un large cytoplasme avec un noyau oval, soit une forme un fuseau avec un cytoplasme peu abondant. Quelques mitoses peuvent être observées. Les lobes thyroïdiens d’une même souris peuvent montrer différents types de lésions. La capacité de capter l’iode et de l’organifier semble décroître avec l’âge des souris comme le démontre la diminution de formation de thyroglobuline iodée et la perte de l’expression membranaire du symport NIS. La prolifération cellulaire, bien que moins importante à tous les âges que celle des

(18)

souris Tg-E7 est plus élevée que chez les souris sauvages. Les foyers de proliférations sont le plus souvent localisés dans les projections papillaires et dans les tumeurs solides (33).

CARCINOMES FOLLICULAIRES

Les carcinomes folliculaires représentent 10 à 20 % des cancers thyroïdiens. Ils présentent différentes variantes histologiques reprises dans la classification de l’OMS :

• Carcinome folliculaire à invasion minime

• Carcinome folliculaire largement invasif

• Variante oncocytaire (à cellules oxyphyles)

• Variante à cellules claires

A l’exception des carcinomes folliculaires à invasion minime, ils sont plus agressifs que les carcinomes papillaires et le diagnostic différentiel entre carcinome folliculaire et adénome folliculaire est parfois très difficile. Aucun marqueur spécifique de l’une ou l’autre de ces pathologies n’existent à l’heure actuelle. La découverte de ce type de marqueur reste un challenge important qui permettrait d’éviter une mortalité de près de 40% à dix ans de ce cancer. La morbidité liée à des thyroïdectomies parfois inutiles est non négligeable et lié à la nécessité d’exclure un carcinome folliculaire. Les carcinomes folliculaires

Différentes anomalies génétiques ont été décrites dans les carcinomes folliculaires tels que des mutations de RAS ou des réarrangements chromosomiques impliquant les gènes Pax8 et PPARγ (67;68). La cascade de signalisation PI3K/Akt est dérégulée soit par amplification des gènes PI3KCA, soit par mutation de celui-ci (69;70).

Des modèles de souris transgéniques présentant une expression spécifiquement thyroïdienne du réarrangement Pax8/PPARγ ont été générées. Celles-ci ne développent que tardivement une discrète hyperplasie thyroïdienne. Le croisement de ces souris avec des souris présentant une délétion hétérozygote du gène PTEN dans la thyroïde ne fait que majorer l’hyperplasie sans entraîner le développement de carcinome (71).

CARCINOMES ANAPLASIQUES

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cancers bien différenciés vers une forme nettement plus agressive ne sont pas complètement élucidés. Les mutations de p53 (72) pourraient contribuer à ce passage en empêchant p53 de jouer son rôle de suppresseur de tumeur (arrêt du cycle cellulaire, sénescence et réparation de l’ADN). La perte de fonction de p53 n’est à elle seule pas capable de mener à un cancer dédifférencié. La voie des MAPK est dérégulée dans les carcinomes anaplasiques de la thyroïde. Les mutations de RAS ou de BRAF retrouvées dans les carcinomes papillaires et folliculaires font penser que ceux-ci pourraient être à l’origine de cancers anaplasiques (73-75). Néanmoins, une succession de mutations indépendantes peut mener à un carcinome anaplasique sans pour autant qu’il y ait un développement préalable de carcinomes folliculaires ou papillaires.

D’autres gènes impliqués dans l’adhésion cellulaire (cascade Wnt) sont souvent mutés dans les carcinomes anaplasiques. Comme pour les carcinomes folliculaires, la cascade PI3K/Akt est souvent dérégulée (70).

Un modèle murin se rapprochant des carcinomes anaplasiques a été développé en induisant l’expression spécifiquement thyroïdienne de l’antigène « large T » dérivé du virus simien SV-40. Ce modèle bien qu’imparfait représente un modèle de tumeur thyroïdienne agressive, perdant les caractéristiques de différenciation du thyrocyte (perte de l’expression de la TPO et de la thyroglobuline, conservation de l’expression du récepteur TSH) (76).

CARCINOMES PEU DIFFÉRENCIÉS

Les carcinomes peu différenciés représentent un groupe de tumeur difficilement classifiables entre les tumeurs différenciées et les carcinomes anaplasiques. Différentes mutations telles que des mutations de p53, RAS, BRAF et β-caténine ont été retrouvées dans ce type de cancers(77-79).

(20)

MÉTHODE D’ANALYSES DE L’EXPRESSION GÉNIQUE DE THYROÏDES IN TOTO.

TECHNOLOGIE DES MICROARRAYS

Les microarrays permettent l’analyse simultanée de l’expression différentielle de plusieurs milliers de gènes dans différentes conditions expérimentales. Les microarrays sont constitués de brins d’ADN correspondant à des séquences connues fixées ou synthétisées sur un support. Ces brins d’ADN sont donc spécifiques d’une séquence donnée et servent de sonde permettant de quantifier la cible recherchée. Quelques picomoles d’ADN sont déposées en un point précis d’une lame de verre et constituent un « spot » permettant à la cible marquée par un fluorophore de s’hybrider en ce point.

La fluorescence mesurée en ce point précis est alors proportionnelle au nombre de cibles ayant pu s’hybrider sur le spot (80).

Les ARNm issus de cellules soumises à une condition expérimentale donnée ou provenant de tissus d’intérêt sont marqués lors de la transcription inverse en ADNc par la cyanine-5 de couleur rouge alors que les ADNc issus de la transcription inverse des ARNm de cellules contrôles sont marqués en vert par la cyanine-3. Les deux échantillons sont déposés simultanément sur la lame de microarrays et permettent à chaque cible d’éventuellement s’hybrider avec une sonde. Un scanner à laser permet de mesurer la fluorescence émise à une longueur d’onde spécifique des deux fluorophore.

Pour chaque spot un rapport des fluorescences rouge/vert est ainsi déterminé, permettant de comparer la quantité d’ADNc hybridés et d’en déduire le niveau d’expression du gène correspondant dans les conditions expérimentales par rapport au contrôle.

Les lames commerciales Affymetrix (81) utilisent un principe légèrement différent, où les sondes sont synthétisées in situ sous forme d’oligonucléotides (25-mers). Chaque gène d’intérêt est représenté par 11 à 20 paires d’oligonucléotides complémentaires à la séquence du gène ou différant d’un nucléotide en position centrale. La coexistence de ces paires d’oligonucléotides permet de détecter

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PCR QUANTITATIVE EN TEMPS RÉEL

La PCR quantitative en temps réel est largement utilisée pour quantifier de façon relative ou absolue l’expression de gènes d’intérêt. La PCR en temps réel utilise le principe de base de la avec pour différence une amplification mesurée tout au long de la réaction.

A chaque cycle d’amplification, la quantité d l’émission est directement proportionnelle à la quantité d une cinétique de la réaction et donc une mesure quantitative de l’ADN alors que la PCR classique ne donne que la mesure finale.

Les courbes obtenues se caractérisent par une phase exponentielle, durant laquelle la multiplication des brins d’ADN dépend de l’efficacité de la réaction. Dans des conditions théoriques, chaque brin d’ADN permet la synthèse de deux brins à chaque cycle. En pratique l’efficacité de la réaction est souvent inférieure à deux. A cette phase exponentielle fait suite une phase non exponentielle et une phase plateau, classiquement non utilisée dans la quantification.

La quantification de l’ADN engagé dans la réaction nécessite de respecter plusieurs étapes essentielles à l’interprétation des résultats. L’ARN purifié doit être d’une qualité suffisante. Il ne doit pas y avoir d’ADN génomique contaminant, en particulier si le gène d’intérêt ne possède pas d’introns. Il ne doit pas y avoir d’inhibiteur de la réaction dans le milieu tel que les groupements hèmes présents dans le sang.

La quantification de l’ADN se base sur l’utilisation du Ct qui correspond à la détermination d’un cycle à partir duquel la fluorescence dépasse la fluorescence du bruit de fond, tout en étant encore dans la phase d’amplification exponentielle de la réaction. Plus le Ct est petit, plus rapidement la fluorescence dépasse le bruit de fond et donc plus grand est la quantité initiale d’ADN engagée dans la réaction. (Figure 4)

Plusieurs systèmes de détection sont utilisés pour la détection ou la quantification du signal fluorescent en temps réel. Ils sont divisés en 2 groupes : les agents intercalants et les sondes (82-84).

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AGENTS INTERCALANTS

Les agents intercalants sont des molécules fluorescentes capables de s’insérer entre les bases appariées d’un acide nucléique. Le bromure d’éthidium est utilisé de longue date pour révéler les l’ADN sur gel d’agarose mais sa toxicité et sa fluorescence de base élevées lui ont fait préférer le SybrGreen dans les réactions de PCR en temps réel. Peu fluorescent à l’état libre, le SybrGreen augmente sa fluorescence lorsqu’il est lié à l’ADN double brin. Il a l’avantage de ne pas inhiber la réaction de PCR. L’augmentation de la fluorescence mesurée pendant l’étape de polymérisation est proportionnelle au nombre d’amplicons formés pour autant qu’aucun dimère d’amorce ne se forme.

L’émission fluorescente décroît fortement lors de l’étape de dénaturation du cycle suivant. Dans ce système, la spécificité de la réaction ne repose que sur la spécificité des amorces. Pour vérifier qu’un seul produit PCR a été amplifié, on réalise une soumettant les amplicons à une température progressant de 55°C à 95°C par palier de 0,5°C et en mesurant l'intensité de fluorescence en continu. La courbe de variation de la fluorescence en fonction de la température obtenue permet de déterminer la température de fusion des amplicons.

Cette température de fusion appelée Tm est représentée par un pic unique spécifique d’un amplicon donné. Si plusieurs pics surviennent à des températures différentes ou si le pic est décalé par rapport au Tm attendu, c’est que l’on est en présence d’un mélange d’amplicons ou d’amplicons ayant une séquence différente de l’amplicon d’intérêt. (Figue 5)

SONDES

Les PCR en temps réel utilisant des sondes ont été développées pour pallier au manque de spécificité des réactions utilisant des agents intercalants, ceux-ci se liant à l’ADN indépendamment de la séquence de celui-ci, émettant une fluorescence d’autant plus importante que la quantité d’ADN est importante, mais également d’autant plus importante que le brin synthétisé est long.

(23)

TAQMAN

Les sondes sont marquées à leur extrémité 5’ par un fluorochrome émetteur (reporter), par exemple

« FAM », et à leur extrémité 3’ par un fluorochrome suppresseur (quencher) fluorescent ou non, par exemple Dabcyl, qui inhibe l’émission du reporter lorsqu’ils sont à proximité. Au cours de la PCR, si la sonde est hybridée sur sa cible, elle est hydrolysée par l’ADN polymérase. Le reporter ainsi séparé du Quencher émet un signal proportionnel au nombre de sondes hydrolysées, mesurable au moment de l’élongation. La spécificité de la réaction est liée à la fois à celle des amorces et à celle de la sonde réduisant significativement l’émission de fluorescence due à des appariements non spécifiques ou des dimères d’amorces. Cette technique présente par ailleurs l’avantage de détecter plusieurs cibles dans le même tube en utilisant différentes sondes marquées avec des fluorochromes ayant des spectres d’émission différents (multiplexage).

Cette technique est très sensible, très spécifique, rapide et permet le multiplexage mais elle manque d’efficacité et de flexibilité dans le cas de mutations variables ou localisées dans les régions comportant des séquences répétées. (Figure 6)

FRET

Dans ce système, on utilise 2 sondes dont l’une est porteuse en 3’ d’un fluorochrome émetteur et l’autre en 5’ d’un fluorochrome accepteur. Les sondes sont choisies de façon à s’hybrider à leurs séquences cibles en n’étant séparées que de 1 à 5 bases. Lorsque les deux sondes sont séparées, le fluorochrome donneur n’émet qu’un bruit de fond de fluorescence alors que lorsqu’elles sont hybridées à moins de 10 nucléotides de distance, la proximité des 2 fluorochromes permet le transfert de l’énergie du fluorochrome donneur vers le fluorochrome accepteur provoquant l’émission fluorescente de ce dernier (FRET : fluorescent resonnance energy transfer). On mesure alors l’acquisition de la fluorescence, proportionnelle à la quantité d’ADN synthétisée, au moment de l’hybridation. Les sondes restant intactes (contrairement aux sondes Taqman qui sont hydrolysées), il

est possible de réaliser un en fin de réaction.

Les sondes FRET sont d’une excellente sensibilité et sont dotées d’une grande capacité de multiplexage mais leur prix est élevé et la présence de mutations non identifiées peut déstabiliser leur hybridation et donc l’interprétation de la réaction. (Figure 7)

(24)

MOLECULAR BEACON

Il s’agit de sondes d’hybridation en épingle à cheveux portant 2 fluorochromes, un reporter et un quencher comme les sondes Taqman. Etant repliées à l’état libre, elles n’émettent pas de fluorescence en raison de la proximité des 2 fluorochromes. Lorsque les sondes sont hybridées, l’éloignement suffisant des 2 fluorochromes libère le reporter permettant ainsi l'émission d'une fluorescence. La lecture de la fluorescence se fait au moment de l’hybridation. Les sondes restent intactes en fin de réaction avec le même avantage que pour les sondes FRET mais leur conception est plus délicate. Ces sondes présentent une grande spécificité permettant de détecter une variation de l’ordre de un nucléotide mais leur prix est très élevé. (Figure 8)

SCORPIONS

Cette technique est une variante des « molecular beacons » : une structure en épingle à cheveux complétée après le quencher d’une molécule d’hexéthylène glycol (HEG) sur laquelle est fixée une amorce. L’HEG empêche l’extension de la balise moléculaire par l’ADN polymérase et l’amorce permet d’intégrer la balise moléculaire dans le nouvel amplicon. La boucle change de conformation (retournement rappelant la queue d’un scorpion) lors d’une renaturation, pour s’hybrider à sa séquence complémentaire sur l’amplicon, permettant l’éloignement du quencher et l’émission du reporter. Ces sondes présentent une grande sensibilité et une grande spécificité. Ce système est préféré pour des PCR comportant des cycles courts. Leur conception est délicate et leur prix élevé.

(Figure 9)

(25)

II BUT DU TRAVAIL

Les modèles de tumorigenèse thyroïdienne sont particulièrement intéressants pour comprendre les étapes nécessaires à la formation d’une tumeur bénigne ou d’une tumeur maligne. Les mutations somatiques intéressant les thyrocytes peuvent mener à des pathologies bénignes telles que les adénomes thyroïdiens ou des pathologies malignes telles que les carcinomes papillaires de la thyroïde. Les modèles tumoraux thyroïdiens se distinguent des autres modèles de carcinogenèse par une excellente connaissance des mécanismes initiaux nécessaires au déclenchement du processus de tumorigenèse. La dérégulation des cascades de signalisation et les éventuelles mutations secondaires menant au phénotype tumoral sont nettement moins bien connues. Une approche globale de l’expression génique in vivo dans des modèles murins connus permettra d’affiner la compréhension des cascades de signalisation favorisant un développement tumoral complet. De nombreuses molécules sont actuellement en phase d’études cliniques afin de réaliser des thérapies ciblées sur les différentes protéines mutées dans les cancers solides. Une bonne connaissance des mutations importantes dans la pathogénie tumorale ne sera probablement pas suffisante pour contrecarrer de manière définitive le processus tumoral (85;86).

Une fois l’approche génique globale réalisée une approche ciblée par mesure quantitative de l’expression génique par PCR quantitative permettra de confirmer et de préciser les modulations d’expression des gènes d’intérêt.

Les buts du travail sont

1. Valider une méthode d’analyse in vivo d’une pathologie tumorale bénigne et démontrer sa capacité à identifier de nouvelles voies de signalisation dont l’implication dans cette pathologie n’était jusqu’alors pas connue.

2. Comparer deux modèles de souris développant des tumeurs invasives de la thyroïde.

3. Développer une méthode quantitative simple de l’expression génique par PCR en temps réel.

(26)

III RÉSULTATS

PROFILS D’EXPRESSION GÉNIQUE DES THYROÏDES ISSUES DES SOURIS TRANSGÉNIQUES TG-A2R

La première partie de cette thèse a visé à étudier un modèle simple mais néanmoins sévère de pathologie tumorale thyroïdienne.

De manière à identifier de nouveaux gènes impliqués dans la tumorigenèse thyroïdienne, nous avons utilisé la technologie des microarrays en étudiant l’expression différentielle de +/- 13000 gènes entre nos souris transgéniques, ayant une activation constitutive de la voie de l’AMPc au sein de leurs thyrocytes et des souris contrôles de même background génétique.

Nous avons ainsi pu mettre en évidence une modulation de près de 360 gènes dont la fonction exacte reste encore à déterminer.

Sur la base de nos résultats, nous avons également soulevé des hypothèses concernant les processus biologiques modulés dans la thyroïde de nos souris transgéniques. Notre modèle nous a aussi permis de suivre l’éventuelle variation de l’expression génique au cours du temps.

(27)

Gene Expression Profile in Thyroid of Transgenic Mice Overexpressing the Adenosine Receptor 2a

JEAN-CHRISTOPHE GOFFARD, LING JIN, HORTENSIA MIRCESCU, PAUL VAN HUMMELEN, CATHERINE LEDENT, JACQUES-EMILE DUMONT,ANDBERNARD CORVILAIN

Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Mole´culaire (J.-C.G., L.J., H.M., C.L., J.-E.D., B.C.), Faculte´ de Me´decine de l’Universite´ Libre de Bruxelles, and Department of

Endocrinology (B.C.), Hoˆpital Universitaire Erasme, 1070 Bruxelles, Belgium; and Microarray Facility (P.V.H.), Katholiek Universiteit van Leuven, 3000 Leuven, Belgium

Mutations of the TSH receptor leading to constitu- tive activation of the cAMP cascade are responsi- ble for the development of hot nodules, if arising in a somatic cell, and nonautoimmune hyperthyroid- ism, when occurring in a germinal cell. An animal model of constitutive activation of the thyroid cAMP cascade has been obtained by generating transgenic mice expressing the adenosine recep- tor (Tg-A2aR) under the control of the thyroglobulin promoter. These mice develop huge goiters and die prematurely due to hyperthyroidism induced cardiac failure. To identify new genes involved in the tumorigenic pathway of the thyroid, we de- signed a protocol using microarray technology to study the differential expression, between normal and transgenic thyroid, of13,000 genes. A total of

360 genes or expressed sequence tags showed a strong modulation with background corrected val- ues of fluorescence superior to 2-fold change. The modulated genes were classified according to their proposed gene ontology functions. Approxi- mately half of them were up-regulated. The func- tion of the majority of these genes in thyroid phys- iology is still to be determined. Some of them, like IGF-I or IGF binding protein 3 or 5, may play an important role in the development of thyroid nod- ules through paracrine mechanisms. This study demonstrates the feasibility of sequentially follow- ing the cascade of events leading to the formation of benign tumors such as hot thyroid nodule or hyperfunctional goiter. (Molecular Endocrinology 18: 194–213, 2004)

T

HYROID TUMORS ARE the most frequent human endocrine tumors. Benign tumors include autono- mous hyperfunctional adenomas that proliferate and re- lease high amounts of thyroid hormones independently of the normal pituitary control. This overstimulation of thyroid follicular cells is due to the permanent activation of the cAMP cascade and is, in the majority of cases, a consequence of somatic mutations in the genes encod- ing the TSH receptor (1) or Gs(2). To reproduce the effect of chronic stimulation of the thyrocyte by the cAMP cascade, three transgenic mouse models exam- ining the oncogenic potential of the constitutively ele- vated cAMP in the thyroid have been developed. These models were all generated using a thyroglobulin pro- moter as the expression of the natural thyroglobulin gene is tightly restricted to the follicular cell of the thyroid gland (3). A fragment of the bovine gene promoter has been shown to limit the expression of the reporter gene to

thyroid cells in transgenic mice. In the first mouse model, ectopic expression of the Gsprotein-coupled receptor, adenosine A2a receptor, leads to permanent stimulation of adenylyl cyclase as a result of the continuous release of adenosine by most cell types (4). In the two other models, Gsis constitutively activated, either directly via an activating mutation of GsR201H (5), or via thyroid specific expression of cholera toxin A1 subunit (6).

In mice, these transgenes promote both cell prolif- eration and function, similar to the effect of the cAMP cascade in primary cultures of dog thyrocytes. This results in the appearance of a differentiated goiter and severe hyperthyroidism. The mice, with a thyroid- specific chronic activation of the cAMP cascade, are the animal corollary of human nonautoimmune familial hyperthyroidism, which is caused by a constitutive stimulation of the thyroid cAMP cascade affecting all thyrocytes from the embryological stage (7). Autono- mous adenoma, arising in response to an activating mutation of the cAMP pathway, share the same patho- genic mechanism but affect only one thyrocyte that grows by clonal expansion. Thus, we can study the precise role of the cAMP cascade in the sequence of events promoting cell proliferation inin vivoconditions and during a long life span. This model is certainly a more physiological model than primary cultures which last a few weeks at the most. Among the three trans- genic mouse models developed to study the role of the Abbreviations: CIDE, Cell-inducing dff45-like effector; Ct,

threshold cycle; DNase, deoxyribonuclease; dNTP, de- oxynucleotide triphosphate; DTT, dithiothreitol; IGFBP, IGF binding protein; MEST, mesoderm-specific transcript; QRT- PCR, quantitative RT-PCR; SDS, sodium dodecyl sulfate;

SSC, saline sodium citrate; Tg-A2aR, transgenic mice ex- pressing the adenosine receptor; TPO, thyroperoxidase.

Molecular Endocrinology is published monthly by The Endocrine Society (http://www.endo-society.org), the foremost professional society serving the endocrine community.

0888-8809/04/$15.00/0 Molecular Endocrinology 18(1):194–213

Printed in U.S.A. Copyright © 2004 by The Endocrine Society

doi: 10.1210/me.2003-0249

(28)

cAMP cascade in the thyroid, we decided to use the Tg-A2aR transgene, created in our lab, as it has the most severe phenotype.

To examine the transcriptional effects of a thyroid permanent activation of the cAMP cascade, we ana- lyzed the changes in global gene expression in the thyroid of transgenic mice using DNA microarrays (8).

This approach enabled the quantification of the effects of chronic cAMP stimulation on approximately 13,000 genes. Results of interest were validated by a real-time PCR assay on different independent samples.

The possible role of these genes in the pathogenesis of these benign tumors is also discussed

RESULTS

Effects of Tg-A2aR Transgene Expression on Gene Expression in the Thyroid

To identify genes differentially regulated by overexpres- sion of the cAMP cascade, we examined the gene ex- pression profiles of mice with thyroid-specific expression of Tg-A2aR transgene compared with C57Bl6 strain mice (control mice). The expression levels of individual genes were examined by comparing the relative hybrid- ization signals from the control and Tg-A2aR (6 months old) mice after double experiments and fluorophore in- version. The experiment was performed twice. Approx- imately 70% of the total 22,000 cDNA fragments spotted in duplicate had an expression level significantly above the background. The correlation between expression levels of duplicate spots was high (Fig. 1) (r20.88;P 0.05). After correction of the background, the expression

level of 360 genes or expressed sequence tags (ESTs) of 13,187 genes represented on the arrays were either de- creased or increased more than 2-fold and, therefore, considered as significantly regulated. By using these criteria, we identified 167 spots representing genes that were significantly up-regulated, of which 94 were ESTs, and 193 spots that were significantly down-regulated, of which 89 were ESTs. Modulation level, Unigene acces- sion numbers, and Gene ontology (9) proposed function are shown in Table 1 for the 73 up-regulated genes and in Table 2 for the 104 down-regulated genes (EST ex- cluded). When considering only the 2151 genes with a known function, according to the gene ontology data- base for the level 3 biological process, 54.7% of the genes spotted on the array are involved in metabolism, 14.7% in signal transduction, 13.5% in transport, 7.9%

in response to external stimulus, 7.8% in cell cycle, 7.16% in cell organization and biogenesis, 5.8% in em- bryogenesis and morphogenesis, 5.1% in cell adhesion, 3.4% in cell death, 1.6% in cell motility, 1.1% in cell proliferation, 1% in cell-cell signaling. The other catego- ries represent less than 1% (Fig. 2). The distribution of regulated genes among the various categories was quite different from the total gene distribution, indicating that the regulation was not randomly distributed. Up-regu- lated genes are more frequent in the following functional categories: transport, cell adhesion, cell-to-cell signaling, cell differentiation, cell growth, and cell proliferation.

Down-regulated genes are more frequent in the func- tional categories related to: response to external stimuli, cell adhesion, cell death and cell-to-cell signaling. Sev- eral categories stand out on closer examination of bio- logical function:

Goffardet al. • Gene Expression Profile in Transgenic Mice Thyroid Mol Endocrinol, January 2004, 18(1):194–213 195

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Table 1.Gene Up-Regulated and Proposed Gene Ontology Function at Different Level of Biological Process

196 Mol Endocrinol, January 2004, 18(1):194–213 Goffardet al. • Gene Expression Profile in Transgenic Mice Thyroid

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Table 1.Continued

Goffardet al. • Gene Expression Profile in Transgenic Mice Thyroid Mol Endocrinol, January 2004, 18(1):194–213 197

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For the down-regulated genes, we identified:

1. Genes involved in glycolysis and lipid metabolism pathways: pyruvate decarboxylase, enolase 3, glyc- erol phosphate dehydrogenase 1, glycogen phos- phorylase for the carbohydrate metabolism and acetyl-coenzyme A synthetase 2, diacylglycerol O-acyltransferase, fatty acid synthase, 2-hydroxy- phytanoyl-coenzyme A lyase, lipoprotein lipases for the lipid metabolism;

2. Genes involved in defense response and chemo- taxis, presumably from cells of the immune system:

cls, cytokines, histocompatibility 2 (antigens Abl, EB1, Bf), Igh (3, and VJ558), Mgl lymphocyte antigen, CD44;

3. The caveolin gene that is involved in NOS activity and angiogenesis; and

4. A gene involved in inhibiting tissue remodeling:

inhibitor of plasminogen activator.

A high proportion of genes are not regulated.

Among these are the genes of ribosomal proteins and

translation factors, mitochondrial proteins, channels, histones, and heat shock proteins,i.e. genes of the basic housekeeping machinery.

All of the differentially regulated genes implicated directly or indirectly in the process of apoptosis were modulated in an antiapoptotic way, the proapoptotic genes (cell death-inducting DNA fragmentation factor, Fsp27, Lsp1, Lga11, Gelsolin) were all down-regu- lated, whereas the antiapoptotic genes were up- regulated (fructose phosphatase 1, Clusterin). In pre- vious Northern blots of the RNAs of A2R thyroids, cyclin D1 expression was increased, whereas cyclin D2 and D3 were slightly decreased (10). The same modulations were also observed in the microarray but not at a level considered to be significant. In the mi- croarrays cyclin D1 mRNA was increased (ratio 1.9), but not significantly, and cyclin D2 and D3 were barely decreased (ratio 0.9).

Table 1.Continued

198 Mol Endocrinol, January 2004, 18(1):194–213 Goffardet al. • Gene Expression Profile in Transgenic Mice Thyroid

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Table 1.Continued

Goffardet al. • Gene Expression Profile in Transgenic Mice Thyroid Mol Endocrinol, January 2004, 18(1):194–213 199

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