Les travaux présentés dans la présente thèse puisent leur importance dans le fait qu’ils ont permis la première caractérisation d’un transporteur membranaire de Si mammalien. Tel que démontré au chapitre 1 de ce travail, et plus spécifique- ment à la section 1.1.2.3, le Si joue probablement une grande diversité de rôles physiologiques chez les mammifères, et l’élucidation des premiers mécanismes moléculaires impliqués dans le transport du Si ouvre la porte vers une meilleure compréhension et appréciation de l’importance de cet oligoélément.
Nous avons mis en évidence la fonction de transport du Si des aquaglycéropo- rines humaines, c’est-à dire AQP3, AQP7, AQP9 et AQP10 (chapitre 4) grâce à différentes approches, incluant des études d’influx, d’efflux et d’incorporation de l’atome chez de oocytes de X. laevis surexprimant les canaux de manière hétéro- logue. En autres, la figure 4.1A montre les influx en Si basaux observés pour les AQPs humaines 1 à 9, de même que pour un transporteur de Si végétal connu, Lsi1. Ces données indiquent que les AQP7 et 9 possèdent une activité de trans- port robuste, et que celle d’AQP3 semble plus limitée. Une autre figure (4.1B), la- quelle décrit l’incorporation et l’extrusion du Si en fonction du temps révèle que le transport s’effectue selon un mode typiquement michaelien. Ces observations sont en accord avec l’hypothèse initialement émise, à savoir que la présence comparti- mentée du Si dans l’organisme et son assimilation nutritionnelle devraient faire appel à des systèmes de transport spécifiques. Le fait que toutes les aquaporines testées avaient la capacité de transporter l’eau, et ce d’une manière qui n’était pas corrélée avec leur capacité du transport en Si (par exemple, AQP1 possède une robuste perméabilité à l’eau mais est incapable de transporter le Si), corrobore l’hypothèse que l’effet observé n’est pas dû à l’entraînement par le solvant (« sol- vant-drag ») mais bien à l’activité des transporteurs.
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Afin de démontrer la validité de l’hypothèse du transport du Si par les AQGPs humaines, nous avons utilisé un isotope radioactif du germanium (32Ge), un ana-
logue du Si, lors d’études d’influx isotopiques. Il appert qu’AQP7 transporte bien le
32Ge dans ce modèle (avec un ratio comparable avec celui du transporteur Lsi1,
Fig. 4.2A). De plus, il a été démontré à la figure 4.2B qu’un mutant d’AQP7 (G264V), reconnu pour son incapacité à transporter l’eau malgré sa présence à la membrane, ne pouvait transporter le Si, et que des variations d’osmolalité du mi- lieu d’incubation des oocytes n’avaient pas d’effet sur l’activité de transport d’AQP7 (fig. 4.2C). Ces résultats appuient d’avantage le scénario selon lequel le transport du Si par les AQGPs serait médié directement par les canaux surexprimés et ne serait pas tributaire de l’influx d’eau à l’intérieur de l’oocyte ou d’une liaison non- spécifique du Si aux protéines surexprimées.
Durant mon doctorat, d’autres études de caractérisation fonctionnelle plus fine d’AQP7 et 9 ont permis de confirmer le comportement michaelien du transport en Si (fig.4.3A) et de démontrer l’insensibilité de ce transport à la concentration extra- cellulaire de différents ions (K, Cl, Na) et aux variations de pH (fig. 4.3B). Elles ont aussi permis d’observer qu’un inhibiteur connu des AQPs, la phlorétine, baissait la perméabilité à l’eau d’AQP9, mais modifiait AQP7 et 9 de façon différentielle pour ce qui est du transport en Si.
Par ailleurs, des études physiologiques ont pu être effectuées sur un modèle murin afin de vérifier l’influence de la quantité de Si présente dans la diète sur l’expression des AQP1, 3, 7 et 9 (fig. 4.4). De façon intéressante, nous avons ob- servé que le nombre de copies d’ARNm des AQP3, 7 et 9 se trouvait significati- vement augmenté au dans le petit intestin suite à une diète pauvre en Si. Ce résul- tat corrobore les données existantes au sujet de l’assimilation alimentaire du Si chez les animaux (voir chapitre 1.1.2.3), suggérant un rôle de ces canaux dans la régulation fine du taux de Si dans le sang.
La deuxième portion des travaux constituant le corps de cette thèse concerne les déterminants structuraux du transport du Si par un transporteur modèle, AQP10. Le choix d’AQP10 comme modèle repose sur la robustesse de son trans-
101 port en Si observée lors d’expériences préliminaires et sa perméabilité relative- ment faible à l’eau. Afin d’identifier quels résidus ou segments d’AQP10 jouent un rôle clé dans la capacité de la protéine à transporter le Si, nous avons entrepris une série d’études structure-fonction à l’aide de chimères AQP1-AQP10, chez les- quelles ont été interchangés soit des résidus uniques, soit des combinaisons de plusieurs résidus ou encore des domaines entiers de ces protéines (voir fig.5.1 et 5.2). Ces expériences ont mis en évidence certains éléments structuraux jouant probablement des rôles importants dans le transport du Si par les AQGPs ani- males.
En premier lieu, il convient de mentionner que le fait d’intervertir les portions centrales (régions inter-NPA) des protéines semble avoir un rôle délétère sur les chimères ainsi crées; ces dernières sont difficilement acheminées à la membrane et exercent donc des activités de transport de Si et d’eau déficientes (fig.5.3). Ces résultats suggèrent ainsi que la capacité des AQGPs animales à transporter le Si repose davantage sur des résidus spécifiques que sur des domaines entiers, mal- gré le fait que les régions inter-NPA d’AQP1 et 10 ne présente que peu d’homologies entre elles.
Le filtre ar/R, structure importante à la sélectivité pour l’eau des différentes aquaporines [152-154], pourrait jouer un rôle important dans celle pour le Si. En modifiant les résidus F56 et H180 d’AQP1 pour des résidus G (lui conférant ainsi le filtre ar/R d’AQP10), une augmentation de la capacité de transport du Si par AQP1 a en effet été observée, et en produisant les modifications réciproques chez AQP10 (possédant le filtre d’AQP1), on obtient plutôt une diminution de la capacité du transport du Si par AQP10. Ces modifications ont été indépendantes du niveau d’expression à la membrane, et n’ont pas affecté la perméabilité à l’eau des pro- téines, bien qu’une certaine tendance à la hausse ait été observée pour le mutant AQP1062+202. Considérant que le filtre d’AQP10 soit plus large que celui d’AQP1, il
est étonnant que le mutant AQP1062+202 ne soit pas plus perméable à l’eau et
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que la sélectivité du transport est déterminée par des éléments structuraux dis- tincts.
En ce qui a trait aux mutations ponctuelles, il a été intéressant de noter que la mutation du résidu L84 chez AQP1 a mené à une perte marquée de capacité de transport de l’eau chez AQP1, et à une hausse substantielle de cette capacité chez AQP10 lorsque le résidu réciproque (C90) était muté. De même, la mutation du résidu N208 chez AQP10 affecte à la baisse sa capacité à transporter le Si ; la mu- tation du réciproque chez AQP1 (Y186) se traduit au contraire par une hausse de la capacité de transport du Si. Il est à noter que ces changements ne sont pas dus à des variations d’expression à la membrane des transporteurs.
Cette deuxième série d’études nous aura permis de commencer à élucider par quels mécanismes structuraux les AQPs exercent une sélectivité face au transport de différents substrats. Plus spécifiquement, nous avons pu constater que le filtre ar/R différent d’AQP10 jouerait un rôle dans la perméabilité au Si, et que le résidu L84 chez AQP1 (C90 chez AQP10) serait un déterminant important dans la per- méabilité à l’eau ; le résidu N208 d’AQP10 serait quant à lui impliqué dans la per- méabilité au Si.