CHAPITRE 4 : ÉTUDES EXPÉRIMENTALES 4.1 Étude du potentiel osteoformateur de la matrice osseuse partiellement déminéralisée dans 4.2.3. Discussion L’objectif de cette étude était d’évaluer le potentiel ostéoformateur de deux substituts osseux que sont la MOPD et le Bio-Oss® dans un modèle d’augmentation osseuse verticale utilisant une chambre à os en PEEK. Le microscanner (µCT) a permis de faire un suivi longitudinal de la néoformation osseuse au cours du temps. Pour ce faire une analyse du volume de radio-opacité à l’intérieur des chambres à os a été réalisée et les résultats ont montré une néoformation osseuse [bone volume (BV)] significativement plus importante dans les chambres à os remplies avec la MOPD aux différents temps opératoires. Cette technique d’évaluation du BV au cours du temps dans les chambres à os a également été utilisée dans plusieurs autres études (Anderud et al., 2014 ; Guo et al., 2013 ; Kochi et al., 2009 ; Kon et al., 2014 ; Oginuma et al, 2012 ; Saito et al., 2013 ; Shino et al., 2016 ; Tsuchiya et al., 2014). L'utilisation de l'imagerie µCT maximise les résultats de chaque animal, fournit des données séquentielles de chaque animal et réduit le nombre d'animaux requis par étude car il n’y a pas besoin de sacrifier les animaux à chaque temps opératoire. L'analyse histologique est considérée comme le gold standard pour évaluer la néoformation osseuse dans les défauts osseux. Les coupes histologiques, préparées en non déminéralisée, observées au microscope ont montré une néoformation osseuse à l’intérieur des chambres à os remplies par la MOPD ou le Bio-Oss® ce qui montre le potentiel ostéoconducteur de ces deux biomatériaux. Cette néoformation osseuse était limitée au tiers inférieur des chambres à os (hauteur ≤ 3mm) et entourait les particules de MOPD ou de Bio-Oss® en formant des ponts osseux par endroit (chambres remplies avec la MOPD). Ces résultats sont similaires à ceux trouvés par Beltrán et al., en 2014. En effet ils ont utilisé un dôme en titane (4.5 mm de diamètre et 3.5 mm de hauteur), remplie d’une allogreffe osseuse sous forme de pâte [demineralized bone matrix (DBM)], fixé sur la calvaria de lapin. Les résultats histologiques ont montré une néoformation osseuse importante sur les 2/3 de la chambre à os et faiblement au niveau du tiers supérieur. Le modèle animal n’est, certes, pas le même mais les hauteurs de néoformation osseuse étaient similaires dans les 2 chambres à os. Zigdon et al., en 2014 ont également trouvé des résultats similaires dans des dômes en or (10 mm de diamètre et 7 mm de hauteur) remplis de Bio-Oss®, de collagène et de β-TCP avec une néoformation osseuse ne dépassant pas 1.5 mm de hauteur. La comparaison directe des images µCT avec les images de l’histologie chez le rat a confirmé la corrélation en ce qui concerne la néoformation osseuse(Cowan et al., 2007). Maréchal et al., en 2005 ont utilisé le µCT et les coupes histologiques pour déterminer l'étendue de la néoformation osseuse sous une barrière occlusive en titane fixée sur la calvaria de lapin ; les résultats étaient fortement corrélés. La même corrélation entre les résultats du µCT et de l’histologie a été trouvée par Kochi et al., en 2010 en utilisant des capsules plastiques remplies ou non d’hydroxy apatite et fixées sur la calvaria de rat. Dans notre étude, l’analyse histomorphométrique a permis de quantifier la néoformation osseuse dans les chambres à os à J60 et qui s’est révélée être plus importante dans les chambres remplies avec la MOPD. Toutefois cette différence de surface de néoformation osseuse entre la MOPD et le Bio-Oss® n’était pas significative contrairement à l’analyse 3D en µCT de la radio-opacité à l’intérieur des chambres à os à J60. Cette non corrélation entre les résultats de l’analyse 3D de la radio -opacité et ceux de l’analyse 2D histomorphométrique s’explique probablement par un échantillonnage réduit lors de l’histomorphométrie. En effet, l’analyse 3D de la radio-opacité a porté sur 150 lames (soit la totalité du volume de la chambre osseuse) tandis que l’analyse 2D s’est basée seulement sur 4 lames histologiques. .Nous avons utilisé dans notre étude une chambre à os en PEEK fixée sur la calvaria de rat pour objectiver une néoformation osseuse par µCT et histologiquement à 2 mois. Ces résultats prouvent que le PEEK est bien biocompatible. Cependant, nous avons noté une formation osseuse le long des parois que dans une des chambres à os remplie avec du Bio-Oss®. Ceci pourrait s’expliquer par le fait que le PEEK a une surface hydrophobe, qui ne permet ni l'absorption de protéines ni la promotion de l'adhésion cellulaire (Noiset et al., 1999). Toutefois ce resultat ne permet pas de conclure à un effet bord de la chambre à os en PEEK. Cinq rats ont eu une exposition puis une ouverture, suite à la perte du couvercle, de leurs chambres à os durant l’étude et ce, suite à une nécrose de la peau apparue à 4 semaines. Cependant, ces rats n’ont présenté aucun signe d’inflammation et d’infection autour de ces dernières et cet incident n’a pas eu d’impact sur l’augmentation osseuse verticale à l’intérieur de ces chambres. La perte du couvercle de la chambre à os était due à l’action des rats. Ces rats ont fait l’objet d’une attention et d’un suivi particulier avec repositionnement régulière du couvercle de la chambre à os jusqu’à la fin de l’étude. La nécrose de la peau précédant l’exposition des chambres à os soulève la question des dimensions de la chambre à os. Celle que nous avons utilisée fait 5 mm de diamètre et 6 mm de haut avec un couvercle aux bords vifs. Malgré l’élasticité importante de la peau des rats, nous pensons que la hauteur importante de la chambre associée aux bords vifs de son couvercle serait à l’origine de la nécrose de la peau à cause des tensions qu’engendreraient les bords vifs sur cette dernière. Zigdon et al., en 2014 ont rapporté les mêmes incidents dans leur étude sur le rat. En effet, ils ont utilisé une chambre à os en forme de dôme en titane, de 10 mm de diamètre et 7 mm de haut, fixée sur la calvaria de rat à l’aide de 2 vis. Les dômes étaient remplis soit de Bio -Oss®, soit du βTCP, soit d’éponge de collagène ou soit laissés vides. La hauteur maximale de néoformation osseuse à deux mois était de 2,5 mm. Dans la littérature, aucune autre étude d’augmentation osseuse verticale chez le rat n’a fait état d’exposition de chambres osseuses durant la période d’expérimentation. Dans toutes les études d’augmentation osseuse verticale utilisant une chambre à os sur calvaria de rat, la hauteur maximale de la néoformation osseuse était de 2,5 mm et ce quelle que soit la hauteur de la chambre (jusqu’à 7 mm), la durée de l’étude (jusqu’à 3 mois) et l’ostéoconductivité du matériau constituant la chambre à os. Compte tenu de cette hauteur maximale de néoformation osseuse dans les différentes études ainsi que du risque d’exposition et de perte des couvercles des chambres à os, nous préconisons pour la calvaria de rat: i) d’utiliser une chambre à os de 4 mm de hauteur hors tout ou sous forme de dôme en absence de couvercle, ii) d’utiliser un couvercle qui se clipse de l’intérieur pour ne pas qu’il soit arrachés par les rats en cas d’exposition, et iii) de chanfreiner le couvercle pour éviter les tensions aux bords qui favorisent la nécrose de la peau. Les coupes préparées en histologie non déminéralisée, observées au microscope optique ont montré la présence de néoformation osseuse en verticale, en continuité des corticales des calvaria et entre et autour des particules de biomatériaux, à l’intérieur des chambres à os. Ceci pourrait être le résultat de la migration des cellules ostéoformatrices à travers les perforations de la corticale de la calvaria, sous les chambres en PEEK, et d’une néoangiogenèse progressive. La formation d’un caillot sanguin (constitué essentiellement d’un réseau de fibrine, de plaquettes, d’éléments cellulaires avasculaires et de globules rouges et blancs) est essentielle et constitue la première étape du processus de cicatrisation d’un défaut parodontal. L’augmentation osseuse guidée pourrait être différente de ce concept. En effet, le concept biologique de la régénération tissulaire guidée repose sur l’exclusion cellulaire dans la zone de cicatrisation en ne permettant que la colonisation par les cellules osseuses contiguës et ce par l’utilisation de différentes types de membranes barrières. Nous avons utilisés une chambre à os vissée sur la calvaria de rat et la migration des cellules ostéoprogénitrices à l’intérieur de cette dernière ne peut se faire qu’à la suite de la perforation de la corticale crânienne. Ainsi, nous avons réalisé, à l’aide d’une fraise boule de 1 mm de diamètre, 3 petits trous afin de promouvoir l’apport sanguin des cellules ostéoformatrices dans les chambres. La question de la décortication de la corticale crânienne, dans l’étude de l’augmentation osseuse verticale, demeure un sujet à controverse. D’un côté nous avons les auteurs qui soutiennent que la perforation corticale n’a pas d’effets significatifs sur la néoformation osseuse tandis que de l’autre côté nous avons les auteurs qui avancent le contraire. En 1999, Rompen et al., ont utilisé des chambres à os en forme de parallélépipède fixées sur les calvaria de rats ; ils ont réalisé des perforations de la corticale osseuse sous les chambres tests et laissé les contrôles intacts. Ils ont ainsi pu montrer que la décortication augmentait l’épaisseur de l’os corticale à 8 et 16 semaines post-opératoires. Ils ont conclu que la perforation corticale qui favorisait l’afflux de sang, stimulait significativement la néoformation osseuse d’autant plus que le rôle majeur de l’angiogenèse dans la formation osseuse guidé a depuis longtemps été prouvé chez le lapin (Schmid et al., 1997). Majzoub et al., en 1999 ont également trouvé des résultats similaires chez le lapin en montrant que les perforations corticales accéléraient la néoangiogenèse initiale, de même que la néoformation et la densité osseuse. Selon ces auteurs plusieurs phénomènes expliqueraient ces résultats : i) l’ouverture de l’espace médullaire suite à la perforation facilite le bourgeonnement des capillaires et améliore la néovascularisation dans la zone à régénérer ; ii) l’augmentation de la présence locale des BMPs et autres facteurs de croissance à partir de la zone de perforation, du périoste et des vaisseaux lésés ; iii) l’accélération des phénomènes locaux engendrées par le traumatisme cortical. Dans la même lancée, Nishimura et al., en 2004, ont associée à une formation osseuse plus rapide. De même, Min et al., en 2007 dans une étude chez le lapin, ont montré que la perforation crânienne entrainait une augmentation osseuse significativement plus importante que dans le groupe sans décortication. D’autres auteurs ont trouvé des résultats tout à fait contraires. En effet, Lundgren et al., en 2000 ont évalué l’effet de la décortication sur la régénération osseuse et n’ont pas trouvé de différence significative dans la quantité de tissus osseux formé, au-delà de l’enveloppe corticale, entre les deux groupes (75.5% ± 10.9% pour le groupe test et 71.2% ± 13.5% pour le groupe contrôle). Ils ont conclu que, chez le lapin, sous les cylindres en titane, la décortication n’apportait pas de bénéfice significatif de néoformation osseuse. Egalement, Slotte et al en 2002, ont suivi le même protocole chez le lapin. A 3 mois post-opératoire, la perforation de la corticale calavariale n’avait pas d’influence sur le volume du tissu osseux au-delà de l’enveloppe squelettique de la calvaria (64.4 ± 18.9% vs 64.9 ±22.2% pour le groupe test et le groupe contrôle respectivement). Il n’y avait pas aussi de différence significative dans la densité osseuse entre le groupe test (21.5 ± 11.1%) et le groupe contrôle (14.7 ± 5.4%). Malgré la controverse qui entoure la perforation ou non de la corticale calvariale dans la régénération osseuse guidée, la nécessité du maintien d’un espace clôt dans la ROG demeure une condition cruciale (Lundgren et al., 1998). Dans cette étude, Les résultats du microscanner ont montré un potentiel ostéoformateur supérieur de la MOPD par rapport au Bio-Oss® dans les chambres à os. Par contre les résultats de l’histologie ont montré un potentiel osstéoformateur équivalent entre ces deux biomatériaux ce qui veut dire que la MOPD fait tout aussi bien que le Bio-Oss® qui demeure une référence en clinique dans le traitement des défauts osseux intra-oraux. Ces résultats intéressant obtenus encouragent l’utilisation de la MOPD comme moyen d’augmentation osseuse verticale. Les résultats de cette étude vont faire l’objet d’une publication. L’article est en fin de rédaction, en phase de correction, et sera soumis très prochainement. CONCLUSION Cette étude s’inscrit dans une logique de compréhension de la cicatrisation osseuse par l’utilisation des allogreffes osseuses comme matériau de comblement et ce pour une meilleure prise en charge des défauts osseux. A ce jour plusieurs types d’allogreffes osseuses ont été utilisés pour le traitement des défauts osseux. Il s’agit notamment de la FDBA, de la DFDBA ou de la DBM sous forme de poudre ou de gel en cas d’utilisation d’un support visqueux. La particularité de cette étude réside dans l’utilisation d’une allogreffe osseuse constituée d’une matrice osseuse partiellement déminéralisée sous forme de pâte injectable. Ce projet de doctorat avait pour objectif d’évaluer in vivo le potentiel ostéoformateur de la MOPD dans deux modèles différents : i) un modèle de défaut de calvaria de rat et ii) un modèle cylindrique d’augmentation osseuse verticale au niveau de la calvaria de rat. Le premier modèle visait à comprendre d’avantage l’impact de la MOPD au cours du processus précoce de la cicatrisation osseuse des défauts de calvaria de rat de différentes tailles (4, 6 et 8 mm de diamètre). Les résultats du µCT et histologiques ont montré une néoformation osseuse significativement plus importante dans les défauts de 6 et 8 mm comblés avec la MOPD comparée à celle des défauts contrôles laissés vides. Par contre dans les défauts de 4 mm de diamètre, on observait une cicatrisation osseuse même en l’absence de la MOPD. Nous avons également montré, dans le défaut de 8 mm de diamètre comblés avec la MOPD, une surexpression à 3 jours des gènes Runx-2, ALP, SP7 et BGLAP impliqués dans l’ostéogenèse et qui pourraient traduire une différenciation in situ des cellules ostéoprogénitrices. Le deuxième modèle visait à évaluer in vivo le potentiel ostéoconducteur de la MOPD dans un modèle cylindrique d’augmentation osseuse verticale au niveau de la calvaria de rat, puis de le comparer à celui de l’os bovin déproteiné (Bio-Oss®) et ce, en utilisant une chambre à os en PEEK vissée sur la calvaria des rats. A huit semaines, les résultats µCT ont monté une néoformation osseuse significativement plus importante dans les chambres à os comblées avec la MOPD comparée à celles comblées avec le Bio-Oss®. Les résultats histologiques ont objectivés le potentiel ostéoconducteur du Bio-oss® et de la MOPD. Même si la néoformation osseuse était plus importante dans les chambres remplies avec la MOPD, la différence avec le Bio-Oss® n’était pas significative. Ce projet de recherche a permis de montrer le potentiel ostéoformateur de la MOPD sous forme injectable dans deux modèles différents chez le rat, ce qui en fait une alternative crédible dans le traitement des défauts osseux parodontaux et de la sphère oro-faciale. Cependant cette étude pourrait être complétée par : - Une étude immunohistochimique pour voir si l’expression de la protéine est corrélée à celle du gène observée par RT-PCR, - Une étude Rt-PCR et immunohistochimique à un temps long (1 mois), - Faire une étude histologique de comparaison à chaque temps opératoire de la biologie moléculaire et de l’immunohistochimie, - Une étude du potentiel ostéoinducteur de la MOPD par implantation ectopique sous cutanée. - Une étude à long terme du potentiel ostéoformateur dans les deux modèle ce qui RÉFÉRENCES Acarturk TO, Hollinger JO. Commercially available demineralized bone matrix compositions to regenerate calvarial critical-sized bone defects. 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