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Submitted on 30 Jun 2021
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d’une matrice osseuse allogénique
Ahmad Moustapha Diallo
To cite this version:
Ahmad Moustapha Diallo. Réparation osseuse de la sphère orofaciale : caractérisation et évaluation du potentiel ostéoformateur d’une matrice osseuse allogénique. Médecine humaine et pathologie.
Université de Paris; Université Cheikh Anta Diop (Dakar), 2020. Français. �NNT : 2020UNIP7165�.
�tel-03274918�
Université de Paris
En cotutelle avec Université Cheikh Anta Diop de Dakar (UCAD)
Ecole Doctorale Hématologie, Oncogénèse et Biothérapies (HOB) N°561 / Laboratoire Biologie, Bioingénierie et Bioimagerie Ostéo-Articulaires (B3OA) UMR CNRS 7052 INSERM U1271
Ecole Doctorale Sciences de la Vie de la Santé et de l’environnement / UER 106 Sciences Odontologiques UCAD
Titre de la thèse
Réparation osseuse de la sphère orofaciale: caractérisation et évaluation du potentiel ostéoformateur d’une matrice osseuse allogénique
Par Ahmad Moustapha DIALLO
Thèse de doctorat de Biothérapies
Dirigée par Fani ANAGNOSTOU Et par Henri Michel BENOIST
Présentée et soutenue publiquement le 27 Novembre 2020
Devant un jury composé de :
Pr Fani ANAGNOSTOU, Professeur, Université de PAaris Directrice Pr Henri Michel BENOIST, Professeur Unversité Cheikh Anta Diop de Dakar Co-Directeur Mme Graciela PAVON-DJAVID, Ingénieur de Recherche, Université Paris 13 Rapporteure Pr Fatou Bintou SARR, Professeur, Université de Thiès Rapporteure Pr Anne PELLÉ, Professeur, Université Paris 13 Examinatrice Dr Hugues PORTIER MCU, Université d’Orléans Examinateur Dr Morad BENSIDHOUM, Chargé de Recherche, Université de Paris Co-encadrant Dr Raphaël BAEDONNET Directeur des Opérations, BIOBANK Invité
Titre : Réparation de défauts osseux de la sphère orofaciale : caractérisation et évaluation du potentiel ostéoformateur d’une matrice osseuse allogénique.
Résumé : Les pertes osseuses de la sphère oro-faciale constituent un problème majeur dans la réhabilitation orale et maxillo-faciale. Elles ont des causes diverses et variées : cancers, kystes, fentes palatines, infections ou traumatismes. La prise en charge de tels défauts osseux nécessite l’utilisation de greffes osseuses. L’os autogène ou autogreffe constitue le gold standard mais présente des inconvénients: i) la nécessité de recourir à un second site opératoire, ii) morbidité subséquente, iii) une augmentation du temps opératoire, iv) une quantité limitée d’os à prélever. Pour pallier à ces écueils, des alternatives thérapeutiques à l’autogreffe osseuse sont utilisés notamment des substituts osseux dérivés des tissus osseux humains (allogreffes), animaux (xénogreffes) ou synthétiques (alloplastiques). Les allogreffes constituent une bonne alternative aux autogreffes et sont, aujourd’hui, largement utilisées en chirurgie reconstructive et régénérative. Ces allogreffes sont soit minéralisées (FDBA : Freeze-Dried Bone Allograft) ou déminéralisées (DFDBA : Demineralized Freeze-Dried Bone Allograft) et se présentent sous forme de poudre ou de gel selon le support utilisé dans le cas des DBM (Demineralized Bone Matrix).
Ce projet de Doctorat avait pour but de montrer le potentiel ostéoformateur d’une nouvelle formulation d’allogreffe osseuse, partiellement déminéralisée sous forme de pâte injectable, dans deux modèles différents au niveau de la calvaria de rat : il s’agit d’une Matrice Osseuse Partiellement Déminéralisée (MOPD).
Le 1
ermodèle est celui de défauts de calvaria de rat. Des défauts de taille
critique (8 mm de diamètre) et sub-critique (6 mm et 4 mm de diamètre)
sont réalisés sur la calvaria des rats puis laissés vides ou comblés avec la
MOPD. Les résultats du micro scanner (µCT) et ceux histologiques ont
montré l’effet positif de la MOPD dans la réparation osseuse des défauts
de 6 et 8 mm de diamètre. De même, la biologie moléculaire (RT-PCR) a montré l’effet positif de la MOPD dans l’expression précoce des gènes impliqués dans l’ostéoformation.
Le 2
emodèle est celui d’augmentation osseuse verticale. Une chambre à os en Polyétherétherkétone (PEEK) de 6 mm de haut et 5 mm de diamètre est fixée sur la calvaria des rats après avoir perforé cette dernière de 3 petits trous de 1 mm de diamètre. Les chambres à os sont remplies soit de MOPD soit d’os bovin déprotéinisé (Bio-Oss
®). Les résultats du µCT et ceux histologiques ont révélé un potentiel ostéoformateur de la MOPD dans les chambres à os.
Ces résultats confortent l’idée que les allogreffes sont une option viable pour le traitement des défauts parodontaux et maxillo-faciaux.
Mots clefs : ostéoconduction, défauts osseux de taille critique, défauts
osseux de taille subcritique, régénération osseuse, défauts de calvaria,
calvaria de rat, matrice osseuse déminéralisée, allogreffes, gel de matrice
osseuse, substitut osseux, chambre à os, augmentation osseuse verticale.
Title: Bone defects Repair of the orofacial sphere: characterization and evaluation of the osteoformative potential of an allogeneic bone matrix.
Abstract: Oro-facial bone loss is a major problem in oral and maxillofacial rehabilitation. They have various and varied causes: cancer, cysts, cleft palates, infections or trauma. The management of such bone defects requires the use of bone grafts. Autogenous bone or autograft is the standard gold but has disadvantages: i) the need for a second surgical site, ii) morbidity, iii) increased operating time, iv) limited amount of bone to be removed. To overcome these pitfalls, alternative therapeutics to bone autograft are used, in particular bone substitutes derived from human (allografts), animal (xenografts) or synthetic (alloplastic) bone tissue. Allografts are a credible alternative to autografts and are nowaday widely used in reconstructive and regenerative surgery. These allografts are either mineralized (FDBA: Freeze-Dried Bone Allograft) or demineralized (DFDBA: Demineralized Freeze-Dried Bone Allograft) and come in powder or gel form depending on the support used in the case of DBM (Demineralized Bone Matrix). This PhD project aims to show the osteoformative potential of a new bone allograft formulation, partially demineralized as an injectable paste, in two different models for rat calvaria; it is a PDBM (Partially Demineralized Bone Matrix).
The first model is the rat calvarial defect model. Critical size defects (8 mm diameter) and sub-critical size defects (6 mm and 4 mm diameter) are performed on rat calvaria and then left empty or filled with the PDBM.
Micro sacnner (µCT) and histological results showed the positive effect of PDBM in the bone repair of 6 and 8 mm diameter defects. Similarly, molecular biology (RT-PCR) showed the positive effect of PDBM in the early expression of genes involved in osteoformation.
The 2nd model is a vertical bone augmentation model. A bone chamber
(custom-made cylinder of Polyetheretherketone) of 6 mm high and 5 mm
in diameter is attached to the rat calvarias after perforating it with 3 small
holes 1 mm in diameter. The bone chambers are filled with either PDBM or
Bio-Oss
®. The µCT and histological results revealed an osteoformative potential for PDBM in the bone chambers.
These results support the idea that allografts are a viable option for the treatment of periodontal and maxillofacial defects.
Keywords : osteoconduction, critical size bone defects, subcritical size
bone defects, bone regeneration, calvarium defects, rat calvarium,
demineralized bone matrix, bone allografts, bone matrix gel, bone
substitute, bone chamber, vertical bone augmentation.
Remerciements
Mes premiers remerciements vont tout naturellement vers Fani ANAGNOSTOU, ma directrice de thèse qui m’a fait découvrir et aimer le monde merveilleux de la recherche pour jouir de cette double casquette de clinicien/chercheur. Je me souviendrai toujours de mes débuts timides dans votre service de p arodontologie à l’hôpital de la Pitié-Salpêtrière et comment vous m’aviez poussé à devenir meilleur et à croire en ce que je faisais. J’ai appris à vos côtés à toujours repousser les limites de la curiosité scientifique. Cette belle aventure s’est poursuivie au laboratoire B3OA où j’ai pu encore davantage apprécier vos qualités de scientifique et de chercheur consciencieuse. Je tiens sincèrement à vous remercier du fond du cœur pour votre encadrement, votre soutien sans faille dans la recherche de financement, votre présence continue et votre expertise de qualité tout au long de ce doctorat. Au-delà de vos qualités scientifiques et pédagogiques, je tenais également à rendre hommage à vos qualités humaines extraordinaires. Je garderai toujours en mémoire votre proposition avec Rebecca de prendre soin de ma tendre épouse, lorsqu’en pleine pandémie de Covid-19, je vous avais dit qu’elle ne se sentait pas bien et ce alors même que je me trouvais à plus de 4000km d’elle. Ce geste m’a touché au plus haut point et je vous en serai éternellement reconnaissant !
J’adresse également mes vifs remerciements à Hervé PETITE pour m’avoir
chaleureusement accueilli dans son laboratoire B3OA. J’ai pu découvrir
tout au long de mon doctorat vos qualités scientifiques pointues, votre
sens du management et votre dimension humaine inestimable. Vous
m’avez permis d’être ingénieur d’étude, n’avez ménagé aucun effort pour
m’aider dans mes travaux, mes recherches de financement et SURTOUT
dans mes démarches administratives oh combien stressantes pour moi.
J’ai toujours trouvé en vous une écoute attentive et des conseils bienveillants. Soyez assuré de ma gratitude !
Je remercie chaleureusement le Pr Henri Michel BENOIST, mon co- Directeur. Merci d’avoir cru en moi, de m’avoir poussé à me perfectionner et de m’avoir incité à faire ce PhD mais surtout d’avoir facilité mes déplacements et de m’avoir mis dans les meilleures conditions afin que j’atteigne cet objectif. Soyez assuré de mon engagement sans faille et de mon dévouement pour le développement et le rayonnement de notre service de Parodontologie et de l’IOS (UCAD). Mes pensées vont également au Pr Papa Demba DIALLO, aujourd’hui à la retraite, que je remercie pour son soutien et ses conseils avisés depuis le début de mon doctorat.
Je ne pourrai jamais assez te remercier Morad BENSIDHOUM car tu m’as communiqué ta passion de la recherche. Ton savoir-faire, ta disponibilité, ta patience et ta bonne humeur m’ont permi de mener à bien mes expériences. Merci pour tout !
Je tiens à exprimer toute ma reconnaissance aux membres de mon jury de thèse. Mes sincères remerciements à Mme PAVON-DJAVID Graciela et au Pr SARR Fatou Bintou d’avoir accepté la charge de rapporteurs ainsi qu’au Pr PELLÉ Anne et à Dr PORTIER Hugues de m’avoir fait l’honneur d’examiner mon travail. Je remercie également Dr BARDONNET Raphaël de BIOBANK, membre invité qui a contribué à l’aboutissement de ce travail en nous fournissant la matrice allogénique et les têtes de fémur fraiches.
Ce doctorat n’aurait pas été possible sans les membres formidables du B3OA, encore présents, ou partis vers d’autres cieux. Merci à Delphine et Esther pour vos conseils précieux et contributions scientifiques. Merci à Marianne de m’avoir formé à la culture cellulaire. Merci à Hanane de m’avoir appris à faire de l’histologie (On sort de ta salle histo 509 dès fois
« les oreilles bouchées » mais avec toujours un travail « perfecto »).
Mention spéciale à Nathanael, l’homme qui a toutes les solutions. Un
grand merci à Jonathan, Channing, Gaëlle (je te souhaite pleins de succès en Belgique), Cibèle, Stéphan, Guili, Mathilde, Manon, Lionnel, Guotian (il faut commencer maintenant à parler français) et Angélina. Un grand merci à Rebecca pour sa contribution à la réussite de ce travail. Je te souhaite de finir ta thèse dans les meilleures conditions tout en étant assuré qu’elle sera de qualité. Ton sens de l’organisation du travail, tes aptitudes de travail en équipe et ton esprit scientifique et critique sont des atouts qui te guideront, certainement, sur la voie de la réussite. Avec Stéphanie (la reine de l’organisation des sorties et des voyages), vous rendez agréable et conviviale la 504. Merci Stéphanie et courage, c’est la dernière ligne droite, ne « lâche surtout pas l’affaire » car la fin proche et tu seras la bienvenue à Dakar. Je n’oublierai pas notre « pétillante » Pauline,
« espiègle » sur les bords, débordante d’imagination et qu’il ne faut surtout pas encourager dans ses délires. Tu as repris les bonnes vieilles habitudes de Cyprien en venant chaque matin « respectueusement » nous dire bonjour. Merci d’égayer le labo et pour ton sens scientifique pointu.
Mention spéciale à mon acolyte et ami Cyprien avec qui j’ai cheminé durant mon master et une partie du doctorat. Merci pour tout ce que tu as fait pour moi pendant ce parcours. Je te souhaite le bonheur absolu avec Aurélie et vous serez toujours les bienvenus à Dakar.
Merci à mon compagnon de thèse Tidiane (courage c’est la fin et bonne chance) et à mes amis Fadel, Abdoul Aziz et Alain.
Je rends grâceà ma famille qui m’a toujours soutenu pour rendre mes rêves possibles et sans qui tout cela ne serait possible. Un immense merci à mes parents pour l’éducation qu’ils m’ont donné et leurs prières qui m’accompagnent au quotidien.
Pour finir je voudrais rendre un vibrant hommage à la future mère de mes
enfants, ma douce moitié, ma tendre et chère épouse, mon tout !!!! Même
dans mes plus doux rêves, je n’aurai imaginé avoir une FEMME comme
toi, tant tu me combles de joie et de bonheur au quotidien. Tu incarnes à
la perfection l’expression « Unis pour le meilleur et pour le pire ». Merci
pour ton soutien inconditionnel surtout en fin de doctorat qui monopolisait
toute mon attention. Malgré cela, tu as toujours gardé ta joie de vivre, ta
bonne humeur, ton sourire légendaire, ton rire réconfortant et ton tendre
regard apaisant. Tu es, assurément, la meilleure chose qui me soit
arrivée, définitivement. Je te dédie ce doctorat, ma tendre épouse for
eternity and beyond.
Liste des principales abréviations
CEU: Carcinome Epidermoïde Ulcérobourgeonnant CA : Crête Alvéolaire
ROG : Régénération Osseuse Guidée BMPs : Bone Morphogenetic Proteins NaCl: Chlorure de Sodium
TCP : Tricalcium Phosphate β-TCP : β-Tricalcium Phosphate HA: Hydrxyapatite
DBBM: Demineralized Bovine Bone Matrix CaSO
4 :sulfate de calcium
FDBA: Freeze-Dried Bonne Allograft
DFDBA: Demineralized Freeze-Dried Bone Allograft BCP: Biphasic Calcium phosphate
PMMA : Polyméthylméthacrylate PHEMA: Polyhydroxyéthylméthacrylate MSC : Cellules Souches Mésenchymateuses M1 : Macrophages de type 1
M2 : Macrophages de type 2
MEB : Microscopie Electronique à Balayage MET : Microscopie Electronique à Transmission TEMP : Tomographie par Emission Monophotonique IRM : Imagerie par Résonnance Magnétique
RMN : Résonance Magnétique Nucléaire
MOPD: Matrice Osseuse Partiellement Déminéralisée CO
2: Dioxyde de carbone
H
2O
2: Eau oxygénée
NaOH : Hydroxyde de sodium EtOH : Ethanol
PEEK : Polyetheretherketone
µCT : Micro scanner ou Microscan
ROI : Région of interest ou Région d’intérêt BV : Bone volume
DBM : Demineralized Bone Matrix PTFE : Polytétrafluoroéthylène BMPs : Bone Morphogenetic Proteins ALP : Phosphatase alcaline
PDBM: Partially Demineralized Bone Matrix FTIR: Fourier Transform InfraRed Spectroscopy DNA: Deoxyribonucleic Acid
RT-PCR: Reverse Transcription‐Polymerase Chain Reaction TNFα: Tumor Necrosis Factor α
IL1β: Interleukin 1 IL6: Interleukin 6 IL8: Interleukin 8
VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor ANG: Angiogenin
CDH5: Cadherin 5
PECAM1: Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule VWf: Von Willebrand factor
ALP: Alkaline Phosphatase
RUNX2: Runt-related transcription factor 2 Cola1: alpha-1 type I Collagen
BGLAP (Osteocalcin): Bone Gamma-Carboxyglutamate Protein SP7: Transcriptor factor Sp7 ou Osterix (Osx)
MMP13: Matrix Metalloproteinase 13 OPG: Osteoprotegerin
RANKL: Receptor Activator of Nuclear Factor Kappa-B Ligand SPARC (Osteonectin): Secreted Protein Acidic and Cysteine Rich HCL: Hydrochloric acid
H
2O: Eau
eSEM: environmental Scanning Electronic Microscopy
KBr: Potassium bromide HFH: Human Femur Heads BBP: BioBank
®Bone Powder
EDTA: Éthylènediaminetétraacétique mRNA: Messenger Acide Ribonucleic RNA: Ribonucleic Acide
AATB: American Association of Tissu Banks SAL : Sterility Assurance Level
FDA: Food and Drug Administration
VIH: Virus de l'Immunodéficience Humaine VHC: Virus de l'Hépatite C
ARN : Acide Ribonucléique
ADN : Acide Désoxyribonucléique MOD : Matrice Osseuse Déminéralisée AH : Acide Hyaluronique
AS : Alginate de Sodium CMC : Carboxyméthylcellulose IGF-1 : Insulin-like Growth Factor-1 TGF: Transforming Growth Factors
EATB: European Association of of Tissue Banks
EAMST: European Association of Musculo Skeletal Transplantation CSP: Code de la Santé Publique
DC: Défaut de Calvaria MEC: Matrice Extracellulaire PTFE : Polytétrafluoroéthylène TiO2 : Dioxyde de Titane FGS : Flap Gingival Surgery
ACP: Amorphous Calcium Phosphate
MBCP= Micro-macroporous Biphasic Calcium Phosphate TPS: Titanium Plasma-Sprayed
CPC: Calcium Phosphate Cement
SBBM: Sintered Bovine Bone Mineral
HA-TCP: Hydroxyapatite Tricalcium Phosphate RO: Régénération Osseuse
EMD: Enamel Matrix Derivative
BDBM: Bovine Demineralized Bone Matrix BBM: Bovine Bone Matrix
HAC: Hydroxyapatite Cement
rhBMP: recombinant human Bone Morphogenic Protein PRF: Platelet Rich Fibrin
PTH: Parathyroide Hormone
PEG: Polyethylene Glycol
Liste des figures
Figure 1: Carcinome épidermoïde ulcérobourgeonnant. ... 2
Figure 2: Kyste radiculaire bilatérale mandibulaire ... 3
Figure 3 : Défaut osseux induit par une parodontite chronique ... 3
Figure 4: Résorption de la crête alvéolaire ... 4
Figure 5: Classification des défauts osseux ... 5
Figure 6: Greffes osseuses et substituts osseux ... 6
Figure 7: Propriétés des allogreffes osseuses ... 12
Figure 8: Traitement d’une tête de fémur par Supercrit
®... 19
Figure 9: Structure chimique de la chitine et du chitosan ... 25
Figure 10: Schéma structural de l’acide hyaluronique ... 25
Figure 11: Structure du collagène de type I ... 27
Figure 12: Diagrammede sélection des articles ... 34
Figure 13: Publications par année d’articles sur les allogreffes osseuses ... 34
Figure 14: Publications par tranche d’année d’articles sur les allogreffes osseuses ... 34
Figure 15: Défaut crânien unilatéral sur la calvaria de rat ... 61
Figure 16: Défauts crânien bilatéraux sur la calvaria de rat ... 61
Figure 17: Chambre à os cylindrique en plastique. ... 63
Figure 18: Chambre à os cyindrique en titane ... 63
Figure 19: Photos de la chambre à os cylindrique en polyetheretherketone (PEEK) ... 108
Figure 20: Schéme expérimental de l'étude ... 109
Figure 21: Photos de la procédure chirurgicale ... 111
Figure 22: visualisation 3D de la radio-opacité ... 116
Figure 23: Images représentatives de la radio-opacité ... 117
Figure 24: Analyse 3D de la radio-opacité dans les chambres à os ... 117
Figure 25: Coupes histologiques représentatives d’une chambre à os comblée avec le Bio- Oss
®à J60 ... 119
Figure 26: Coupe histologique représentative d’une chambre à os comblée avec le Bio-Oss
®à J60 ... 120
Figure 27: Coupe histologique à l’intérieur d’une chambre à os comblée avec le Bio-Oss® à J60. ... 120
Figure 28: Coupes histologiques représentatives d’une chambre à os comblée avec la MOPD à J60 ... 121
Figure 29: Coupe histologique d’une chambre à os comblée avec la MOPD à J60 ... 122
Figure 30: Coupe histologique d’une chambre à os comblée avec la MOPD à J60 ... 122
Figure 31: Analyse histomorphométrique de la néoformation osseuse dans les chambres à os
à J60 ... 123
Table des tableaux
Tableau 1: supports visqueux les plus utilisés en fonction de leur poids moléculaire ... 24
Tableau 2: Avantages et inconvénients des allogreffes osseuses ... 30
Tableau 3: Etudes ayant utilisées des allogreffes osseuses chez le rat. ... 35
Tableau 4 : Etudes ayant utilisées des allogreffes osseuses chez le lapin. ... 39
Tableau 5 : Etudes ayant utilisées des allogreffes osseuses chez le chien. ... 42
Tableau 6 : Etudes ayant utilisées des allogreffes osseuses chez le cochon. ... 43
Tableau 7 : Etudes ayant utilisées des allogreffes osseuses chez le porc domestique, la brebie et le macaque. ... 44
Tableau 8: taille de défaut critique chez quelques modèles animaux ... 60
Table des matières
INTRODUCTION --- 1
CHAPITRE 1 : PROBLEMATIQUE CLINIQUE --- 2
1.1. Défauts osseux ... 2
1.2. Techniques de reconstruction ... 5
1.3. Objectif ... 8
CHAPITRE 2 : GREFFES OSSEUSES ET SUBSTITUTS OSSEUX --- 9
2.1. Cahier de charge des matériaux de substitution ... 9
2.2. Différents types de matériaux ... 11
2.2.1.
Greffe osseuse et substituts osseux d’origine naturelle --- 122.2.1.1. Os autogène ... 12
2.2.1.2. Substituts osseux xénogéniques ou xénogreffes ... 13
2.2.1.3. Carbonates de calcium ... 14
2.2.1.4. Substituts osseux allogéniques ou allogreffes ... 15
2.2.1.4.1. Sources (obtention des allogreffes) ... 15
2.2.1.4.3. Traitement des allogreffes osseuses ... 17
2.2.1.4.4. Support des allogreffes osseuses ... 22
2.2.1.4.5. Considérations biologiques ... 28
a. Ostéoconductivité ... 28
b. Ostéoinductivité ... 28
2.2.1.4.6. Avantages et inconvénients des allogreffes osseuses ... 30
2.2.1.4.7. Applications cliniques ... 31
a. Chirurgie orale ... 31
b. Chirurgie cranio-faciale ... 31
c. Chirurgie de la main et du pied ... 31
d. Chirurgie orthopédique ... 31
e. Chirurgie spinale ... 31
2.2.1.4.8. Réglementation ... 32
2.2.1.4.9. Apport des allogreffes osseuses dans la réparation osseuse au niveau de la sphère oro-faciale ... 33
a. Question posée ... 33
b. Stratégie de recherche ... 33
c. Résultats ... 33
d. Commentaires ... 45
2.2.2. Substituts osseux alloplastiques ou synthétiques --- 50
2.2.2.1. Sulfate de calcium ... 51
2.2.2.2. Bioverres ... 52
2.2.2.3. Phosphates de calcium ... 52
2.2.2.3.1. Hydroxyapatite (HA) ... 53
2.2.2.3.2. Phosphate tricalcique (TCP) ... 54
2.2.2.3.3. Céramiques biphasées (BCP ou Biphasic Calcium phosphate) ... 54
2.2.2.3.4. Ciments de phosphate de calcium (injectables) ... 55
2.2.2.4. Matériaux composites ... 55
2.2.2.4.1. Avec collagène... 55
2.2.2.4.2.
Polymères d’acide acrylique/hydroxyde de calcium... 552.2.2.4.3. Hydrogels ... 55
CHAPITRE 3 : VALIDATION PRECLINIQUE DES BIOMATERIAUX --- 56
3.1. Critères de sélection des modèles animaux dans le développement des substituts osseux ... 56
3.2.
Sites d’implantation ... 583.3. Calvaria ... 59
3.4. Défauts de calvaria ... 60
3.5.
Modèle d’augmentation osseuse verticale ... 623.6. Cicatrisation osseuse chez le rat ... 64
3.7.
Méthodes d’investigation du tissu osseux néoformé ... 653.7.1. Techniques radiologiques --- 65
3.7.2. Analyse histologique --- 66
3.7.3. Microscopie électronique --- 66
RÉSULTATS --- 68
CHAPITRE 4 : ÉTUDES EXPÉRIMENTALES --- 69
4.1 Étude du potentiel osteoformateur de la matrice osseuse partiellement déminéralisée dans un modele de defaut de calvaria de rat ... 69
4.2 Étude du potentiel osteoformateur de la matrice osseuse partiellement déminéralisée dans
un modele d’augentation osseuse verticale sur calvaria de rat ... 1044.2.1. Matériel et méthode --- 107
4.2.1.1. Biomatériaux ... 107
a. Matrice osseuse partiellement déminéralisé sous forme de pâte ... 107
b. Bio-Oss® ... 107
4.2.1.2. Design expérimental et modèle animal ... 107
4.2.1.2.1. Animaux... 107
4.2.1.2.2. Chambre à os ... 108
4.2.1.2.3. Schéma expérimental ... 108
4.2.1.2.4. Procédure chirurgicale ... 109
a. Anesthésie ... 109
b. Chirurgie ... 109
c. Suivi post-opératoire ... 112
4.2.1.3. Analyse tomodensitométrique ... 112
4.2.1.3.1. Acquisition microscanner in vivo... 112
4.2.1.3.2. Reconstruction 3D et analyse micro-scanner in vivo ... 112
4.2.1.4. Sacrifice des animaux ... 113
4.2.1.5. Analyse histologique et histomorphométrique ... 113
4.2.1.5.1. Histologie ... 113
Fixation, déshydratation et inclusion ... 113
Technique de coupe ... 113
Coloration ... 114
4.2.1.5.2. Histomorphométrie ... 114
4.2.1.6. Analyse statistique ... 114
4.2.2. Résultats --- 115
4.2.2.1. Observations cliniques ... 115
4.2.2.2. Analyse micro-scanner in vivo ... 115
4.2.2.3. Analyse histologique ... 118
4.2.2.4. Analyse histomorphométrique ... 123
4.2.3. Discussion --- 124
CONCLUSION --- 129
RÉFÉRENCES --- 131
ANNEXES --- 154
INTRODUCTION
CHAPITRE 1 : PROBLEMATIQUE CLINIQUE
1.1. Défauts osseux
Les déficits osseux de la sphère oro-faciale constituent un problème majeur dans la réhabilitation orale et maxillo-faciale. Ils ont des causes diverses et variées : cancers, kystes, fentes palatines, infections ou traumatismes.
Les tumeurs malignes de la sphère oro-faciale sont localisées au niveau muqueux, cutané, osseux, glandulaire ou encore nerveux et vasculaire. Plus de 90% de ces tumeurs malignes sont des carcinomes épidermoïdes (Hussein et al., 2017) qui peuvent se développer au dépend de l’os ou envahir l’os au cours de leur développement d’où les pertes osseuses. Ces tumeurs posent un réel problème de santé publique car il y a environ 680.000 nouveaux cas dans le monde. En France, il y avait environ 11.610 nouveaux cas estimés en 2015 (Menard et al., 2018) (figure 1).
Il existerait près de 20 types de kystes et de pseudo-kystes des maxillaires. Les kystes épithéliaux odontogènes sont les plus évolutifs, représentant 35% des kystes maxillaires et se présentent radiologiquement sous forme de perte de substance osseuse (Sauveur et al., 2008). Ils résultent d’une inflammation ou d’un développement pathologique de l’épithélium dentaire au cours de sa formation. Les 4 kystes odontogènes les plus fréquents sont les kystes périapicaux, les kystes dentigères, les kystes résiduels et les kératocystes odontogènes (Rajendra Santosh, 2020) (figure 2).
Figure 1: Carcinome épidermoïde ulcérobourgeonnant (CEU) de l'arcade mandibulaire antérieure droite (a).
Radiographie panoramique montrant l’extension osseuse du CEU de l’arcade mandibulaire antérieure
Au niveau des maxillaires, la perte osseuse est aussi principalement due : i) à des infections parodontales, ii) des infections péri-apicales iii) et à la résorption de la crête alvéolaire consécutive à une perte de dents.
Les infections parodontales aboutissent à une parodontite qui est une pathologie très fréquente avec en France une prévalence de 50% (Bourgeois et al., 2007). La parodontite induit une destruction irréversible et une migration apicale du système d’attache. La perte d’attache s’accompagne d’une destruction du ligament parodontal et de l’os alvéolaire qui soutiennent la dent (figure 3).
Figure 2: Kyste radiculaire bilatérale mandibulaire (flèches blanches) (Rajendra Santosh, 2020)
Figure 3 : Radiographie panoramique montrant un défaut osseux induit par une parodontite (flèche
blanche) (a). (b) photographie montrant le défaut osseux lors du lambeau d’assainissement
La résorption de la crête alvéolaire à la suite d’une perte dentaire est un phénomène physiologique qui constitue un défi majeur dans la réhabilitation orale et maxillofaciale (figure 4). Il existe plusieurs types de défauts en fonction de la morphologie de la crête alvéolaire : les défauts osseux horizontaux, verticaux ou mixtes (figure 5). Les déficits osseux mixtes impliquant une résorption verticale et/ou horizontale sévère, exigent une régénération osseuse supracrêstale pas toujours aisée pour le clinicien. En effet, la crête alvéolaire se résorbe graduellement après une avulsion dentaire induisant d’une part une diminution de la surface d’appui et de la rétention de la réhabilitation prothétique, et d’autre part, une difficulté pour la pose d’implants dentaires tant d’un point de vue fonctionnel qu’esthétique. Une bonne gestion des extractions dentaires dans la phase préimplantaire permet d’assurer et de garantir le résultat esthétique et fonctionnel des traitements implantaires (Lombardi et al., 2018). La perte osseuse qui se produit après une avulsion dentaire ne peut pas être complètement compensée par l’activité ostéoblastique induisant une néoformation osseuse. En effet, il se produit une forte activité ostéoclastique sur les versants externes vestibulaire et lingual de l’alvéole d’extraction alors même que l’alvéole se remplie d’os néoformé. Cette activité ostéoclastique entraine une réduction de l’épaisseur et de la hauteur de la crête alvéolaire beaucoup plus marquée au niveau vestibulaire (Araújo et Lindhe, 2005 ; Fee, 2017).
Figure 4: Résorption de la crête alvéolaire (CA) au cours du temps après une avulsion dentaire. (a) Réduction importante de la hauteur de la crête alvéolaire. (b) Réduction importante de l’épaisseur de la crête alvéolaire.
Images extraits du site http://www.1888implant.com/french/bone-grafting.html visité le 05/05/2020.
1.2. Techniques de reconstruction
Ces pertes osseuses de la région orofaciale constituent donc un défi clinique difficile, en particulier dans le cas de défauts importants, lorsque leur capacité de régénération physiologique est dépassée, mais surtout dans les cas de défauts mixtes.
Afin de traiter ces défauts osseux de la sphère orofaciale des greffes osseuses ou de substituts osseux sont réalisées (Da Silva et al., 2020 ; Yahav et al., 2020 ; Koutouzis et al., 2019). L’autogreffe osseuse a fait l’objet de la plus grande attention en tant que biomatériau de premier choix. Elle est considérée comme le gold standard pour le comblement et la réparation des défauts osseux. Cependant l’autogreffe présente plusieurs inconvénients: i) la nécessité de recourir à un second site opératoire, ii) la morbidité subséquente, iii) une augmentation du temps opératoire, iv) et la quantité limitée d’os à prélever. Pour pallier ces inconvénients, des alternatives thérapeutiques sont utilisées incluant plusieurs types de substituts osseux dérivés des tissus osseux (allogreffes et xénogreffes) ou synthétiques (alloplastiques) (figure 6). Ces substituts osseux doivent répondre à un cahier de charge précis et posséder notamment des propriétés d’ostéoconduction (pour servir de charpente aux cellules ostéogéniques) et d’ostéoinduction (avoir des facteurs capables d’entraîner la différenciation des cellules souches mésenchymateuses en cellules ostéogéniques). Ils doivent aussi être disponibles en quantité
Figure 5: Classification des défauts osseux (Seibert JS, 1983). Classe I : perte osseuse vestibulo-linguale (horizontale), hauteur normale de la crête. Classe II : perte osseuse corono-apicale (verticale), crête de largeur normale. Classe III : perte osseuse mixte (verticale et horizontale)
suffisante et posséder un très faible taux d’antigénicité ou de risque d’infection. Toutefois, à l’heure actuelle, aucun de ces biomatériaux ne peut se prévaloir d’être exempt d’inconvénients.
Les pertes de substances osseuses mixtes sont fréquentes et rendent difficile la mise en place d’implants dentaires ; il y a donc nécessité d’une reconstruction osseuse préimplantaire qui fait appel à la correction des déficits osseux maxillaire ou mandibulaire, habituellement employée, pour rétablir la morphologie osseuse. Pour ce faire il existe plusieurs techniques :
i) La régénération osseuse guidée (ROG) : les techniques chirurgicales d'augmentation de crête osseuse aussi bien horizontale que verticale correspondent aux techniques de ROG. Dans cette ROG, un comblement osseux sera utilisé de même qu’une membrane afin de réaliser une exclusion tissulaire et permettre une régénération osseuse en évitant la colonisation par les cellules gingivales. L’augmentation osseuse horizontale ou verticale de la crête peut également se faire à l’aide de blocs osseux. Une récente revue systémique n’a pas montré de différences dans l’efficacité de l’augmentation osseuse entre des blocs
Figure 6: Greffes osseuses et substituts osseux (Anagnostou et Ouhayoun, 2000)
d’os autogène et allogénique. Toutefois, il y avait un risque augmenté de complications avec les blocs d’os allogéniques (Starch-Jensen et al., 2020 ; Malik et al., 2020).
ii) Augmentation du plancher du sinus maxillaire : c’est la procédure chirurgicale la plus couramment utilisée pour augmenter la hauteur de l'os alvéolaire du maxillaire postérieur avant ou pendant la pose d'un implant dentaire. Les résultats du traitement impliquant différents types de matériaux de greffe sont bien documentés (Starch-Jensen et al., 2018). Cette technique peut être associée ou non à une membrane. Des études ont montrées que l’utilisation d’une membrane améliorait le succès de l’augmentation du sinus, en maintenant sur place le matériau de greffe, ainsi que la survie des implants dentaire placés dans ce sinus greffé (Ohayon et al., 2019 ; Ting et al., 2017).
iii) La distraction osseuse verticale et horizontale : ce sont des techniques utilisées pour l’augmentation des crêtes avec un certain nombre d’avantages et d’inconvénients. La distraction osseuse verticale présente l’avantage de ne pas nécessiter de matériau de greffe alors que la distraction osseuse horizontale est de moins en moins utilisée à cause du risque de fracture mandibulaire (De Groot et al., 2018).
Le traitement de ces pertes de substance nécessite donc l’utilisation d’une greffe osseuse.
Face aux inconvénients des autogreffes, les allogreffes osseuses apparaissent aujourd’hui comme une alternative crédible dans la réparation des défauts osseux (Stumbras et al., 2019). Elles se présentent sous forme de poudre, de particules ou de pâte. Cette dernière forme nécessite de mélanger l’allogreffe osseuse avec des supports visqueux tels que l’acide hyaluronique, le sulfate de calcium et autres (Zhang et al., 2019). Face aux effets secondaires de ces supports visqueux (Russell et al., 2020) il y a nécessité de développer de nouvelles allogreffes osseuses sous forme injectable pour le traitement des déficits osseux. Avant leur utilisation clinique, ces biomatériaux doivent être caractérisés in vitro avant que leur efficacité in vivo sur un modèle animal ne soit testée.
En raison de la diversité de forme des défauts osseux de la sphère orofaciale, il existe
plusieurs modèles animaux capables de mimer ces défauts et permettre ainsi d’évaluer
l’efficacité de ces biomatériaux. La calvaria de rat est un modèle très utilisé dans la
recherche qui présente plusieurs avantages que nous aborderons plus en détail dans le chapitre 3 de la thèse. Ainsi pour reproduire la perte osseuse horizontale de la crête alvéolaire on peut utiliser le modèle de calvaria de rat qui autorise la réalisation de défauts de taille critique et subcritique (Vajgel et al., 2014). Cette même calvaria de rat peut être aussi utilisée pour mimer les pertes osseuses verticales de la crête alvéolaire et dans ce cas une chambre à os sera fixée sur la calvaria après perforation ou décortication de cette dernière (Hoornaert et al., 2019). Dans les deux modèles, le biomatériau sera mis soit dans le défaut de calvaria ou à l’intérieur de la chambre à os ce qui permettra d’étudier son comportement et son effet in vivo.
1.3. Objectif
L’objectif de ce projet de doctorat était d’évaluer in vivo le potentiel ostéoformateur d’une matrice osseuse partiellement déminéralisée (MOPD) sous forme injectable dans deux modèles différents : i) un modèle de défaut de calvaria de rat et ii) un modèle cylindrique d’augmentation osseuse verticale au niveau de la calvaria de rat.
Ce projet de doctorat sera structuré comme suit :
- Après avoir posé la problématique clinique dans le chapitre 1, une revue bibliographique sur les greffes osseuses et substituts osseux pour le traitement des défauts osseux, sera effectuée dans le chapitre 2 en insistant sur l’apport des allogreffes osseuses dans la cicatrisation osseuse orofaciale chez l’animal,
- Le chapitre 3 sera consacré à la validation préclinique des substituts osseux,
- Enfin dans le chapitre 4 seront exposés les résultats expérimentaux obtenus au cours de ce doctorat.
Les travaux effectués au cours de ce Doctorat ont été réalisés au sein du Laboratoire
Biologie, Bioingénierie et Bioimagerie Ostéo-Articulaires (B3OA) UMR CNRS 7052 INSERM
U1271 avec pour but de contribuer à l’amélioration de la cicatrisation osseuse orofaciale par
l’utilisation d’une nouvelle formulation d’allogreffe osseuse, partiellement déminéralisée
sous forme de pâte injectable.
CHAPITRE 2 : GREFFES OSSEUSES ET SUBSTITUTS OSSEUX
2.1. Cahier de charge des matériaux de substitution
Les matériaux de substitution doivent répondre à un cahier de charge précis. Ils doivent avoir une composition chimique proche de celle de l’os. La cristallinité, la surface spécifique, la rugosité de surface, la porosité et la taille des cristaux sont des facteurs importants à prendre en compte, de même que les propriétés des greffes osseuses autologues et allogéniques. Le substitut osseux idéal devrait ainsi être biocompatible, ostéoconducteur, ostéoinducteur, biorésorbable facile d’utilisation et peu coûteux tout en ayant une intégrité structurelle similaire à celle de l’os.
La biocompatibilité du matériau de substitution designe sa capacité à ne pas provoquer de réaction inflammatoire importante, ni de toxicité envers les tissus receveurs et les cellules qu’il peut héberger (Tang et Hu., 2005). Il peut être aussi bioactif c’est-à-dire avoir la propriété d’accélérer la réparation tissulaire. Ces matériaux se caractérisent par des interactions chimiques avec la matrice osseuse.
La nature de l’interface biomatériau/hôte va guider le processus d’ostéoconduction qui définit la capacité du matériau à permettre l’adhésion, la migration des cellules sur sa surface, et le dépôt de tissu osseux au contact direct du matériau sans aucune interposition fibreuse.
L’ostéoinduction quant à elle, est la capacité active du biomatériau, à orienter des cellules
indifférenciées vers la voie ostéogénique et à induire la formation d’os au sein d’un site non
osseux. L’ostéoinduction peut être induite par des Bone Morphogenetic Proteins (BMPs)
seules ou combinés à un matériau. La porosité et l’interconnectivité sont aussi des
propriétés essentielles à l’activité biologique d’un biomatériau destiné à la régénération
osseuse.
La porosité est définie par le diamètre moyen des pores et le pourcentage de vide qu’il représente par rapport au volume total de matériau. La porosité conditionne in vitro la colonisation cellulaire et in vivo l’infiltration cellulaire, la vascularisation et les interactions avec le milieu biologique (Paulo et al., 2017). La porosité totale est définie comme la somme de la macroporosité et de la microporosité. La macroporosité est obtenue grâce à l’ajout d’un agent porogène lors de la synthèse du matériau (billes de naphtalène, NaCl, peroxyde d’hydrogène etc). La taille des macropores dans le cas des biomatériaux actuellement développés pour la substitution osseuse est le plus souvent comprise entre 100 μm et 600 μm. Des pores de petite taille peuvent favoriser la chondrogenèse suivie de l’ostéogenèse alors que des pores de plus grand diamètre semblent favoriser la formation d’os via un processus de réparation intramembranaire (Jin et al., 2000). La microporosité définit des pores de diamètre compris entre 1 μm et 10 μm. Elle permet la diffusion des fluides biologiques et les échanges ioniques. In vitro, un faible volume poreux peut stimuler la différenciation ostéoblastique. In vivo, un volume poreux élevé permettra une augmentation de l’ostéogenèse liée, en partie, à l’augmentation de la vascularisation (Karageorgiou et Kaplan, 2005). La porosité favorise donc la migration des cellules dans le biomatériau et améliore aussi la surface disponible pour la liaison cellule-biomatériau et l'interaction avec les tissus environnants. L’impression 3D permet également de fabriquer des substituts osseux poreux servant d’échafaudage comme le phosphate tricalcique (TCP) et qui ont une résistance à la compression augmentée ainsi qu’une capacité de néoformation osseuse dans des défauts osseux chez le rat (Zhang et al., 2019). L’interconnectivité des pores permet la communication entre les pores de la surface du matériau et ceux au centre de celle-ci, la porosité est alors dite ouverte. L’interconnectivité permet la circulation des fluides biologiques entre les pores, et une colonisation cellulaire optimale (Guarino et Ambrosio, 2010).
Une autre propriété d’un biomatériau ou substitut osseux à considérer est sa résorbabilité.
Le matériau doit être résorbable ce qui permet son remplacement progressif par le tissu
osseux néoformé. La biodégradation d’un biomatériau peut être de nature physico-chimique
(dissolution ou précipitation) due à l’interaction entre sa surface et l’environnement
biologique. La dégradation peut également être liée à une activité cellulaire ; en effet, les
ostéoclastes peuvent, de la même façon qu’ils dégradent le minéral osseux, résorber
quelques biomatériaux comme certaines céramiques de phosphate de calcium (Vogel et al., 2004). D’un point de vue pratique, le matériau doit être disponible sous différentes formes galéniques (granules, poudre, blocs) et facile d’utilisation; les biomatériaux injectables sont de plus en plus privilégiés pour rendre les interventions chirurgicales moins invasives, optimiser le contact du matériau avec les berges du défaut osseux et permettre une régénération osseuse quelle que soit la forme de la lésion osseuse. Les propriétés mécaniques des matériaux doivent par ailleurs être adaptées aux sites d’implantation auxquels ils sont destinés. Les contraintes dynamiques sont, par exemple, différentes en site d’implantation mandibulaire ou en site fémoral.
Pour Sundelacruz et Kaplan (2009), trois facteurs sont nécessaires pour assurer les fonctions d’ostéoconduction, d’ostéoinduction et d’ostéogenèse d’un substitut osseux :
i) la présence d’un support tridimensionnel permettant la migration et l’adhésion cellulaire (ostéoconduction),
ii) la présence de cellules souches mésenchymateuses capables de proliférer et de se différencier, sous l’influence des facteurs de croissance, en ostéoblastes jusqu’à la formation de la matrice extracellulaire osseuse (ostéogénèse),
iii) la présence de facteurs de croissance ostéoinducteurs afin de stimuler la prolifération et la différenciation des cellules souches mésenchymateuses vers la voie ostéoblastiques (ostéoinduction).
A l’heure actuelle, aucun substitut osseux ne répond à toutes ces exigences et ces substituts sont souvent utilises en association avec de l’os autologue, des facteurs de croissance (BMPs, dérivés plaquettaires), du matériel d’ostéosynthèse ou un autre moyen de stabilisation osseuse tels que les membranes.
2.2. Différents types de matériaux
On observe la greffe osseuse autologue et les matériaux de substitution osseuse qui peuvent
être d’origine naturelle ou synthétique (Sheikh et al., 2017).
2.2.1. Greffe osseuse et substituts osseux d’origine naturelle 2.2.1.1. Os autogène
IL est utilisé depuis plusieurs années selon différentes techniques. Il a en outre des propriétés mécaniques (os cortical) et ostéogéniques (os spongieux) optimales qu’aucune autre greffe allogénique ou xénogénique ni aucun matériau alloplastique ne possède (Seban et al., 2006). L’autogreffe osseuse est constituée d’une matrice minéralisée qui lui confère son ostéoconductivité, de facteurs de croissance responsables de son ostéoinductivité et de cellules ostéocompétentes assurant son ostéogénicité (figure 7). L’autogreffe osseuse peut être prélevée au niveau des sites extra-ou intra-buccaux (os iliaque, os pariétal, ramus, zone rétro-molaire, tubérosité maxillaire, région de la symphyse méntonienne). L’os mandibulaire autogène est communément utilisé sous forme de copeaux, de blocs ou sous forme broyée.
L’autogreffe osseuse, du fait de ses propriétés d’ostéogenèse, reste la technique de choix dans les procédures de reconstitution de défauts et de pertes osseuses dans la cavité buccale. L’os cortical autogène a une solidité initiale élevée qui diminue d’environ 50% au bout de 6 mois d’implantation par rapport au tissu osseux normal physiologique (Wilk, 2004). Inversement, l’os spongieux autogène est initialement fragile à cause de sa structure poreuse et gagne en solidité par la suite (Sheikh et al., 2013). L’autogreffe spongieuse se revascularise plus précocement que l’autogreffe corticale grâce à son architecture spongieuse.
Figure 7: Propriétés des allogreffes osseuses
