Discrimination des fonctions azotures

Dans ce contexte, l’étude de la discrimination des fonctions azotures a été envisagée afin de poursuivre notre projet portant sur la conception d’une enzyme de synthèse. En effet, La réactivité des azotures reste assez peu explorée, mais les travaux réalisés jusqu’ici ne révèlent aucun effet significatif de la structure sur la vitesse de réaction,108,109 hormis pour quelques espèces activées telles que les azotures carbonylés ou sulfonylés, et pour certains azotures concus pour pouvoir complexer le cuivre lors de la réaction.110

Afin de déterminer le potentiel d’un système de tri moléculaire capable de différencier les fonctions azotures, plusieurs composés ont été étudiés (Figure 122). Les dérivés 187 et 188

108

A. A. Kislukhin, V. P. Hong, K. E. Breitenkamp, M. G. Finn, Bioconjugate Chem. 2013, 24, 684-689. 109

(a) Z. Gonda, Z. Novák, Dalton Trans. 2010, 39, 726-729 ; (b) C. Shao, G. Cheng, D. Su, J. Xu, X. Wang, Y. Hu, Adv. Synth. Catal. 2010, 352, 1587-1592.

110

Chapitre III : Développement d’un système de tri moléculaire capable de mimer le fonctionnement d’une enzyme

139 possèdent une structure différente, et permettront d’étudier l’influence des interactions

aromatiques. Les composés 188 et 66 varient par la longueur de la chaîne séparant la fonction azoture de la fonction éther. Enfin, la nature de l’azoture 183 est différente de celle des dérivés 66, 187 et 188, et le rôle de ce paramètre pourra également être évalué.

Les expériences de discrimination des fonctions azotures sont réalisées en introduisant dans le milieu réactionnel : 5 éq. de chaque dérivé azoture (183, 66, 187, la synthèse des dérivés 183 et 187 a été adaptée à partir de la préparation du composé 6629 et est décrite dans la partie expérimentale), 5 éq. de 1-heptyne 180, 1 éq. de macrocycle 143, 0,8 éq. de [Cu(CH3CN)4](PF6). Les réactions sont effectuées à température ambiante. Les réactions de

contrôle dans les mêmes conditions mais sans macrocycle 143 permettent d’étudier l’influence de ce dernier sur la discrimination. Les résultats sont présentés dans le Tableau 4. Dans un premier temps, le rôle des interactions aromatiques dans le phénomène de reconnaissance a été évalué en réalisant une expérience de tri entre les composés 187 et 188 (Tableau 4, entrée 1). Le rapport obtenu indique une réactivité comparable (189/190 = 55/45), et la réaction de contrôle conduit à la même observation. Les interactions aromatiques n’ayant guère d’incidence sur le tri, le composé 188 a été conservé pour réaliser l’expérience suivante.

Afin d’étudier l’influence de la longueur de chaîne, les composés 188 et 66 ont été comparés (Tableau 4, entrée 2). Les résultats indiquent que la longueur de la chaîne alkyle entre les fonctions éther et azotures n’a que peu d’influence sur le tri, avec (190/191 = 59/41) ou sans macrocycle 143 (190/191 = 55/45).

Lors de la dernière expérience de tri moléculaire, le rôle de la nature de la fonction azoture a été évalué en comparant les azotures 183 et 66 (Tableau 4, entrée 3). Une discrimination significative a pu être observée (71/29 en faveur du composé 66) et la réaction de contrôle conduit à un tri tout à fait opposé, avec un rapport de 33/67 en faveur du composé 183. Contrairement aux expériences de tri catalytique réalisées sur la fonction alcyne, le macrocycle joue donc ici un rôle important. En effet, la présence du complexe macrocycle- cuivre dans le milieu réactionnel inverse la tendance.

Chapitre III : Développement d’un système de tri moléculaire capable de mimer le fonctionnement d’une enzyme

N3 O O N3 O N3 N3

Figure 122 - Eléments utilisés pour l’étude de l’influence de la fonction azoture sur le tri.

N N N O N N N O N NN O N N N

Figure 123 – Produits formés lors des expériences de discrimination des fonctions azotures.

Entrée

Eléments de tri Pourcentages en composés formés

187 188 66 183 180 189 190 191 184 1 + + - - + 55 45 Contrôle 1 + + - - + 59 41 2 - + + - + 59 41 Contrôle 2 - + + - + 55 45 3 - - + + + 71 29 Contrôle 3 - - + + + 33 67

Tableau 4 - Résumé des réactions de tri moléculaires catalytiques réalisées sur la fonction azoture et résultats obtenus. Les réactions de contrôle sont effectuées sans macrocycle. Rapports calculés en RMN 1H.

Les différentes expériences qui ont été réalisées ont révélé une faible influence des interactions aromatiques et de la longueur de chaîne entre les fonctions éthers et azotures des substrats. En revanche, le dernier essai a démontré que la présence d’une fonction éther

66 183 180

187 188

Chapitre III : Développement d’un système de tri moléculaire capable de mimer le fonctionnement d’une enzyme

141 Bien que nous n’ayons pu déterminer avec certitude la nature exacte du rôle que joue le

macrocycle 143 dans la discrimination des fonctions azotures, les différentes expériences qui ont été réalisées nous permettent de formuler une hypothèse : l’une des fonctions carbamates présente sur le macrocycle pourrait former une liaison hydrogène avec la fonction éther des composés les plus réactifs (Figure 124).

Cu HN O O N O N O O O N O O CF3 R H R1 H N N N O R2 n _{n = 0,1}

Figure 124 – Schématisation de l'hypothèse faisant intervenir une liaison hydrogène.

Cette hypothèse semble cohérente avec les résultats obtenus lors des expériences de discrimination des fonctions azotures, mais la réactivité d’autres composés devra être explorée pour la confirmer. A titre d’exemple, le composé 192 (Figure 125), pouvant potentiellement former deux liaisons hydrogène avec le macrocycle, pourrait être étudié ultérieurement.

N N3

O

H

Figure 125 - Structure d'un élément de tri potentiellement plus intéressant que le composé 66.

Cette piste devrait permettre de mieux comprendre le rôle du macrocycle sur le phénomène de tri, et d’en augmenter ainsi l’efficacité.

Notons également que si cette hypothèse se vérifie, le phénomène de reconnaissance serait alors dû à la complémentarité entre le substrat et le macrocycle 143, et notre système pourrait ainsi mimer le fonctionnement d’une enzyme naturelle.

Chapitre III : Développement d’un système de tri moléculaire capable de mimer le fonctionnement d’une enzyme

4. Conclusion

En dépit des nombreux systèmes capables d’exprimer certaines propriétés des enzymes naturelles, l’élaboration d’une enzyme de synthèse reste un défi de taille pour les chimistes. Dans ce contexte, la conception de nouveaux systèmes de reconnaissance semble nécessaire afin de pouvoir réaliser une enzyme artificielle.

Notre projet consistait à développer un système de tri moléculaire grâce à un phénomène de reconnaissance supramoléculaire lié à un composant macrocyclique comprenant un site catalytique.

Après avoir envisagé un système mettant en jeu une discrimination stérique, qui s’est avérée inefficace, nous nous sommes penchés sur le caractère catalytique du phénomène de tri. Les premières expériences réalisées dans cette optique ont révélé que le système de tri était capable de former une liaison covalente de façon catalytique entre deux composés sélectionnés parmi plusieurs possibilités. L’influence du macrocycle lors de ces premiers essais s’est avérée mineure, et les travaux se sont alors dirigés vers la discrimination des fonctions azotures.

Le rôle des interactions aromatiques et de la longueur de la chaîne lors du phénomène de reconnaissance a été étudié, et s’est révélé mineur. La dernière expérience, visant à explorer l’influence de la nature de la fonction azoture, a permis de dévoiler l’importance de la liaison éther pour obtenir une discrimination, ainsi que le rôle prépondérant du complexe cuivre- macrocycle, dont la présence inverse totalement la tendance du tri.

Ces travaux ont également permis de proposer une hypothèse qui fait intervenir la formation d’une liaison hydrogène entre certains substrats et le macrocycle, et permet d’expliquer l’influence de ce dernier sur la discrimination des fonctions azotures.

Bien que le projet n’ait pu être mené à terme au cours de ces travaux de thèse, les derniers résultats permettent d’envisager avec confiance la poursuite de cette étude, qui fera l’objet de recherches supplémentaires au laboratoire.

Conclusion générale

145 Les systèmes moléculaires sont constitués d’unités distinctes, qui se coordonnent pour

permettre l’émergence d’une propriété, ou d’un comportement complexe. Les molécules entrelacées, et notamment les rotaxanes, sont des composés particulièrement adaptés à la réalisation de tels systèmes, en raison de la liaison mécanique qui les caractérise.

Il y a une dizaine d’années, la mise au point de la méthode dite de reconnaissance active par un métal a permis d’accéder aux rotaxanes avec de bons rendements, permettant ainsi le développement de nombreuses machines moléculaires, dont le fonctionnement est souvent lié à la liberté de mouvement inhérente à la liaison mécanique. Nonobstant ces avancées considérables, les applications pour de tels systèmes moléculaires restent assez rares. Afin d’enrichir le panel de fonctionnalités des rotaxanes, nous avons entrepris l’étude de trois nouveaux concepts.

Nous avons élaboré le premier rotaxane enzymo-sensible capable de libérer sélectivement un agent anticancéreux, grâce aux actions successives de deux hydrolases. L’originalité de ce système réside dans l’ouverture contrôlée du macrocycle, qui conduit au désassemblage des constituants entrelacés.

Pour réaliser cette étude, les modèles 62 et 88 ont été préparés, et ont permis de valider le mécanisme d’auto-immolation du macrocycle qui doit permettre la libération du fil, les processus enzymatiques responsables du ciblage des cellules cancéreuses ainsi que la fonction de bouclier moléculaire du macrocycle vis-à-vis des estérases. Ces résultats nous ont alors permis de développer le vecteur 57, premier rotaxane enzymo-sensible capable de libérer sélectivement le paclitaxel au sein des cellules tumorales. Des tests d’hydrolyse enzymatique dans le plasma de rat et des expériences in vitro ont permis de valider ce concept. L’introduction du Taxol®_{en fin de synthèse permet en outre d’envisager le développement de}

vecteurs similaires, transportant d’autres drogues potentiellement hydrophobes, sans changement majeur dans la voie de synthèse.

Ces travaux, sans précédents dans la littérature, ouvrent la voie à un nouveau secteur de recherche, destiné à évaluer les propriétés biologiques des molécules entrelacées.

Le deuxième projet développé dans ce manuscrit s’intéresse à la chiralité particulière qui existe chez les rotaxanes, appelée chiralité mécanique, et à son utilisation potentielle comme stimulus permettant d’exercer un contrôle du mouvement à l’échelle moléculaire. En effet, de nombreuses machines moléculaires naturelles fonctionnent grâce au mouvement qui existe

Conclusion générale

entre les différents éléments qui les composent, et la chiralité reste une source de contrôle du mouvement assez peu explorée.

Notre concept innovant consistait à réaliser la synthèse diastéréosélective de rotaxanes comprenant un fil symétrique et un macrocycle dissymétrique. La partie linéaire de ces rotaxanes est dotée de deux stations affines avec le macrocycle, et il est possible de bloquer ce dernier sur l’une d’entre elles en introduisant une espèce métallique. Dans ce cas, le rotaxane, achiral lorsque le macrocycle circule le long du fil, devient chiral.

Au cours de ces travaux, un nouvel outil a été développé afin de faciliter l’analyse des diastéréoisomères mécaniques de rotaxanes. Il s’agit du macrocycle 143, qui comporte une copule chirale fluorée. L’élaboration des rotaxanes 140 à 142 comprenant des fils dissymétriques a permis de vérifier l’utilisation de ce macrocycle dans la réaction de formation de rotaxanes, ainsi que la distinction aisée des diastéréoisomères mécaniques en RMN 19F.

Dès lors, la synthèse des rotaxanes 134 à 136 dont les parties linéaires comportent deux stations a été entreprise, et l’introduction de cuivre a permis de constater que le rotaxane 135 est le meilleur candidat pour l’étude du mouvement à l’échelle moléculaire. L’utilisation d’un contre-ion chiral a alors conduit à la formation d’un seul signal en RMN 19F. Il semble donc possible de former le complexe cuivre-rotaxane de façon diastéréosélective. Des études complémentaires sont en cours au laboratoire afin de confirmer ce résultat. S’il se vérifie, nous aurons élaboré le premier système de synthèse diastéréosélective de rotaxanes présentant une chiralité mécanique planaire, et le premier exemple de mouvement contrôlé grâce à un stimulus lié à la chiralité mécanique.

Enfin, le dernier projet portait sur l’élaboration d’un système moléculaire capable de mimer le fonctionnement d’une enzyme. Ce système doit être en mesure de fonctionner de façon catalytique au sein d’un mélange pour conduire à la formation sélective d’une molécule parmi une multitude de possibilités.

L’utilisation d’un complexe macrocycle-cuivre a été envisagée pour réaliser cette enzyme de synthèse. En effet, à l’instar des enzymes naturelles, le centre catalytique d’un tel système est confiné à l’intérieur d’une structure organique qui restreint son accessibilité.

L’étude a été mise en œuvre avec le macrocycle 143 et le cuivre [Cu(CH3CN)4]PF6 afin de

Conclusion générale

147 Des travaux préliminaires effectués sur des rotaxanes ont permis de confirmer que la réaction

a bien lieu dans la cavité du macrocycle et que ce dernier devrait donc jouer un rôle important pour la discrimination des substrats.

Le processus de tri catalytique a ensuite été mis en œuvre, en discriminant les fonctions alcynes dans un premier temps. La différence de cinétique observée a pu être corrélée avec les résultats décrits dans la littérature, et l’influence du macrocycle s’est avérée mineure.

La discrimination des fonctions azotures, dont la réactivité dans le cadre d’un couplage CuAAC a été peu étudiée, a alors été explorée. Après avoir constaté l’incidence mineure de la longueur de chaîne et des interactions aromatiques, une expérience a permis de dévoiler l’importance de la fonction éther pour le phénomène de reconnaissance. Au cours de cet essai, la présence du macrocycle a permis d’inverser le rapport obtenu avec la réaction de contrôle. Les résultats obtenus au cours des différentes expériences nous ont permis de formuler une hypothèse permettant d’expliquer ces observations. Ce postulat fait intervenir l’existence d’une liaison hydrogène entre la fonction éther du substrat et l’un des carbamates du macrocycle. D’autres expériences devront toutefois être réalisées afin de confirmer cette hypothèse.

Des travaux ultérieurs pourront s’intéresser à la conception de macrocycles décorés de têtes de reconnaissances, telles qu’un motif uracile, afin d’améliorer le phénomène de tri et de développer des enzymes artificielles élaborées.

Les différents projets présentés ici ont permis d’élargir le panel de fonctionnalités développées pour les rotaxanes. De manière intéressante, les macrocycles qui ont été synthétisés possèdent tous un squelette similaire, et la modification d’un seul élément a permis de concevoir des systèmes aux propriétés très différentes.

Cette observation laisse présager de l’avenir des molécules entrelacées, dont les propriétés émergentes permettent de développer des systèmes aux fonctionnalités extrêmement variées.

Partie expérimentale

151

1. Généralités

1.1. Atmosphère inerte

Sauf mention contraire, les réactions sont réalisées sous atmosphère inerte.

1.2. Réactifs chimiques et solvants

Les réactifs commerciaux proviennent de chez Sigma-Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France), Fluka (division de Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France), Acros Organics (Halluin, France) ou Alfa-Aesar (Schitigheim, France) et n’ont pas subi de traitement ou de purification particulière avant d’être utilisés.

Les solvants anhydres, achetés chez Sigma-Aldrich et Fluka, sont stockés sur tamis moléculaire et sous atmosphère d’azote. Le THF est fraîchement distillé sur sodium, en présence de benzophénone, sous atmosphère d’azote.

Sauf mention contraire, les solvants utilisés pour les réactions sont de qualité HPLC et proviennent de chez Sigma-Aldrich.

1.3. Suivi des réactions et purification

L’avancement des réactions et la pureté des produits ont été contrôlés par chromatographie sur couche mince de silice (CCM) déposée sur plaque d’aluminium (plaques commerciales MACHEREY-NAGEL ALUGRAM® SIL G/UV254, 0,2 mm de gel de silice 60). Les tâches

ont été visualisées sous une lampe UV de 254 nm, et/ou en plongeant la plaque dans une solution éthanolique d’acide phosphomolybdique, dans une solution aqueuse de permanganate de potassium ou dans une solution éthanolique de ninhydrine, avant d’être chauffées au décapeur thermique.

Les colonnes de flash chromatographie ont été montées en utilisant un gel de silice MERK 60 (15-40 m) comme phase stationnaire. Les chromatographies flash automatiques désignent des chromatographies sur colonne qui ont été réalisées avec un appareil REVELERIS® iES équipé de détecteurs UV et ELSD, et en utilisant des cartouches flash de silice 40 m, Resolv® ou Reveleris®.

Partie expérimentale

Dans certains cas, des plaques préparatives de silice ont été utilisées pour la purification des produits. Ces plaques ont été préparées au laboratoire, en utilisant le gel de silice Merck Kieselgel 60 F254).

1.4. Analyse des composés synthétisés

Les spectres RMN du 1H et du 13C ont été enregistrés à 400 et 100 MHz, respectivement, sur un spectromètre BRUKER 400 AVANCE III Plus. Les spectres 1H et 13C des composés 89, 57 (rotaxol) et 60 ont été enregistrés à 500 et 125 MHz sur un appareil Bruker équipé d’une cryosonde TXI-1H-13C-15N (5mm), à la plate-forme PRISM de l’Université de Rennes. Les spectres RMN du 19F ont été enregistrés à 376 MHz et les déplacements chimiques ( ) sont calculés en prenant pour référence l’étalon externe de l’appareil, l’hexafluorobenzène. Les déplacements chimiques sont rapportés en partie par million (ppm) du haut champ vers le bas champ, en prenant comme référence le pic résiduel du solvant deutéré utilisé (CDCl3,

CD2Cl2, DMSO-d6, MeOD). Les constantes de couplages (J) sont exprimées en hertz (Hz).

L’attribution des signaux a été réalisées à l’aide de séquence mono- et bidimensionnelles (DEPT 135, COSY H-H, HSQC, HMBC). Les abréviations suivantes ont été utilisées pour décrire la multiplicité des signaux :

s : singulet sl : singulet large

d : doublet m : massif

t : triplet mult. : multiplet

q : quadruplet dd : doublet dédoublé

qt : quintuplet qdt : quadruplet de triplets

td : triplet dédoublé

Les points de fusion (Pf) ont été mesurés avec un appareil BÜCHI Melting Point B-545.

Les spectres de masse haute résolution (SMHR) ont été réalisés en infusion directe au Centre Régional de Mesures Physiques de l’Ouest (CRMPO) de l’Université de Rennes, à l’Institut de Chimie Organique et Analytique (ICOA) de l’Université d’Orléans ou à l’Institut de Chimie des Milieux et des Matériaux de Poitiers (IC2MP) de l’Université de Poitiers, sur des spectromètres haute résolution ESI Q-Tof 2, Waters ; Q-Tof MaXis, Bruker ; LC-QTof MaXis Impact, Bruker, respectivement.

Partie expérimentale

153 1.5. Analyse et purification par HPLC

Le suivi des réactions, et l’analyse par HPLC de certains produits ont été réalisé sur un appareil HPLC DIONEX Ultimate 3000 équipé d’un détecteur UV/Visible à longueur d’onde variable et d’une colonne chromatographique phase-inverse Acclaim®

(120, C18, 250x4,6 mm, 5 m, 120 Å) dans un compartiment thermostaté à 30°C. L’intégration a été réalisée grâce au logiciel Chromeleon version 6.80 SP1 Build 2238. Les éluants utilisés sont A (H2O +

TFA 0,2%) et B (ACN), et les chromatogrammes sont enregistrés à 254 nm. Une seule méthode a été utilisée pour le suivi réactionnel et l’analyse des produits :

Programme rotaxanation : Gradient linéaire A/B 80/20 à 0/100 en 30 minutes Débit : 1 mL.min-1

Les purifications par HPLC semi-préparative ont été effectuées avec un système VWR LaPrep équipé d’un spectrophotomètre LaPrep P314, d’une pompe préparative LaPrep P110 et d’une colonne semi-préparative ACE®

C18-AR (100x10 cm, 5 m) à température ambiante. La méthode est identique à celle de la HPLC analytique, hormis le débit qui passe de 1 mL.min-1 à 4 mL.min-1. Les éluants utilisés sont A (H2O) et B (ACN).

Les expériences LC/MS sont réalisées sur un système UHPLC Accela, couplé à un spectromètre de masse haute résolution hybride Q-Exactive. Une colonne Acclaim® (120, C18, 250x4,6 mm, 5 m, 120 Å) à 30°C a été utilisée pour la séparation, après injection de 20 μL d’échantillon. L’élution a lieu à un débit de 0,5 mL.min-1_{et l’effluent de colonne passe à}

travers un détecteur PDA Accela avant d’être introduit dans la source d’ionisation par electrospray (ESI) du spectromètre de masse. Les analyses des données ont été effectuées avec le logiciel Xcalibur.

Partie expérimentale

2. Hydrolyses enzymatiques

Le composé 88 a été incubé à 37°C dans du tampon phosphate (0,02M ; pH = 7) contenant 10% de DMSO, à une concentration de 0,1 mg.mL-1. 48 unités (48 U.mL-1 ; 1046 U. mol-1) de -galactosidase (Escherichia Coli E.C. 3.2.1.23, 768 unités/mg de protéine (biuret), en suspension à 50% dans le glycérol, pH 7,3) ont été additionnées en quatre fois, à 40 minutes d’intervalle, et la composition du mélange a été suivie par HPLC (programme rotaxanation).

Programme rotaxanation 88 110

Temps de rétention (minutes) 20,50 23,03

Hydrolyse enzymatique du composé 110

Le composé 110 a été incubé à 37°C dans du tampon phosphate (0,02M ; pH = 7) contenant 10% de DMSO, à une concentration de 0,1 mg.mL-1. 20 unités (20 U.mL-1, 253 U. mol-1) d’estérase (esterase from porcine liver E.C. 3.1.1.1, 150 unités/mg de protéine (biuret), en suspension à 3,2 mol.L-1dans le sulfate d’ammonium, pH 8) ont été ajoutés en une fois, et la composition du mélange a été suivie par HPLC (programme rotaxanation).

Programme rotaxanation 110 Acide 113

Temps de rétention (minutes) 23,03 16,74

Stabilité du Rotaxane 88

Le composé 88 a été incubé à 37°C dans du tampon phosphate (0,02M ; pH = 7) contenant 10% de DMSO, à une concentration de 0,1 mg.mL-1. 20 unités (20 U.mL-1, 435 U. mol-1) d’estérase (esterase from porcine liver E.C. 3.1.1.1, 150 unités/mg de protéine (biuret), en suspension à 3,2 mol.L-1dans le sulfate d’ammonium, pH 8) ont été ajoutés en une fois, et la composition du mélange a été suivie par HPLC (programme rotaxanation).

Programme rotaxanation 88 Acide 113

Partie expérimentale

155 Hydrolyse enzymatique du rotaxol

Le rotaxol a été incubé à 37°C dans du tampon phosphate (0,02M ; pH = 7) contenant 10% de DMSO, à une concentration de 0,5 mg.mL-1. 60 unités (60 U.mL-1 ; 750 U. mol-1) de -