Chapitre I. Etude Bibliographique et Objectifs
3. Caractérisation des lipides
3.2 La diffraction des rayons X
3.2.1 Principe
La technique la plus précise pour l’identification des différentes formes polymorphiques présentes dans un système lipidique est la diffraction des rayons X.
Le principe de cette technique d’étude de la matière résulte de la propriété des rayons X d’être diffractés dans des directions privilégiées de l’espace dès qu’une certaine organisation atomique ou moléculaire est rencontrée. Comme les différents plans consécutifs du réseau spatial cristallin ont des distances voisines des longueurs d’onde des rayons X, ces plans agissent donc comme un réseau de diffraction pour ce type de rayonnement. Par exemple, pour une incidence thêta donnée, les ondes diffusées par les différents plans d’un cristal interfèrent et se retrouvent en phase si leur différence de marche est égale à un nombre entier de longueur d’onde. Ceci conduit à la relation de Bragg :
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( )θ .λ
sin
.
.
2 d = n
avec : d = distance entre deux plans parallèles et consécutifs du réseau cristallin en Å;θ = angle d’incidence en degré ; n = nombre d’ordre de la diffraction ;
λ = longueur d’onde du faisceau incident en Å.
Figure 16. Schéma de principe de la diffraction.
Cette relation met en évidence que pour une longueur d’onde donnée (λ), la diffraction d’un faisceau incident par des plans équidistants ne peut se produire que pour une incidence θ donnée. A partir de cette formule, il est possible de calculer pour une longueur d’onde λ et un angle θ donnés, la distance réticulaire d/n correspondante. L’ordre 1, avec n = 1, détermine la distance réticulaire entre deux plans consécutifs et renseigne sur l’épaisseur d de la strate considérée. En général, plusieurs réflexions correspondant à des ordres différents sont observées et permettent de préciser l’épaisseur de la strate.
La diffraction des rayons X permet par conséquent d’accéder directement aux organisations longitudinales et transversales des molécules lipidiques. Usuellement, les distances réticulaires correspondant aux organisations longitudinales sont appelées « grandes distances » et sont observées aux petits angles, autour de 2 θ = 1 – 15°. Par opposition, les organisations transversales des chaînes hydrocarbonées aliphatiques, qui sont observées aux grands angles entre 2 θ = 16 – 25°, sont désignées par le terme « petites distances » car elles
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correspondent à des distances réticulaires comprises entre 3 et 5 Å. Les petites distances réticulaires donnent des renseignements sur l’organisation de la sous-cellule cristalline (α, β’ et β). Les grandes distances permettent elles d’obtenir des informations sur l’organisation longitudinale (2L, 3L…), mais également sur la taille des cristaux.
3.2.2 Description des sous-cellules par diffraction des rayons X
Les trois formes polymorphiques principales ont été étudiées par DRX et à un diagramme correspond un type de structure (Larsson, 1972; Small, 1986) :
- La variété obtenue suite à un refroidissement brutal de l’état liquide et qui présente une unique raie de diffraction, relativement large, centrée à environ 4.15 Å est la forme α.
- La variété cristalline qui présente soit deux raies intenses aux petites distances centrées à 3.8Å et 4.2 Å ou soit trois raies intenses à 4.27, 3.97 et 3.71 Å est la forme β’.
- Enfin, la variété cristalline qui ne répond à aucun de ces critères est appelée β. Généralement, la forme β présente une raie intense vers 4.60 Å et deux pics à 3.9 Å.
Pour pouvoir déterminer précisément la structure des triacylglycérols par DRX, il faut avoir des mono-cristaux, ce qui est relativement contraignant. Pour pallier ce problème, il est possible de réaliser des diagrammes de poudre par diffraction des rayons X. La comparaison des données obtenues avec des structures connues permet de déterminer l’arrangement des chaînes aliphatiques et l’orientation générale des molécules. En présence d'un mélange, il est nécessaire d’effectuer une déconvolution pour observer les spectrogrammes des différentes espèces. Les structures de la tricaprine et de la trilaurine ont été complètement décrites, et ce sont elles qui ont servi de références pour déterminer l’ensemble des structures des triacylglycérols.
3.2.3 Etude des systèmes en dynamique
Les analyses en dynamique permettent de déterminer les propriétés de cristallisation des systèmes, ainsi que de réaliser les diagrammes binaires ou ternaires et d’étudier
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l’intersolubilité des triacylglycérols. Cependant, il faut un temps d’analyse relativement court pour suivre rapidement les changements de structures.
La première méthode utilisée afin d’obtenir des informations en dynamique a été un couplage de la diffraction des rayons X et de la calorimétrie. Ces deux techniques permettent de mieux connaître les transitions dans les milieux complexes, puisque grâce à la calorimétrie il est possible d'observer les transitions, et la DRX permet d'analyser les composés formés. Ce système de couplage a permis d’obtenir des informations sur la cristallisation de la matière grasse du lait, mais également d’observer les différentes formes polymorphiques et d’empilement longitudinal de triacylglycérols saturés homogènes (Lavigne, 1995; Lopez et al., 2000; Lopez et al., 2001; Lopez et al., 2002; Allais et al., 2003).
Cependant, les récentes améliorations dans l’intensité et la focalisation des rayons X réalisées par les sources synchrotrons ont rendu possible les analyses par DRX en fonction du temps. C’est une technique très intéressante pour pouvoir suivre la formation de cristaux de lipides lors de cinétiques rapides ou lorsque les cristaux sont très dilués. Kellens a ainsi pu caractériser la cristallisation et les transformations polymorphiques de la tripalmitine pure, et mélangée à de la tristéarine (Kellens et al., 1990; Kellens et al., 1991a; Kellens et al., 1991b). Sato utilise également cette technique régulièrement pour déterminer les propriétés structurales des triacylglycérols en mélange comme il a été explique dans la partie précédente. Une application originale de la diffraction des rayons X avec une source synchrotron est l’étude de la cristallisation de matières grasses comme la matière grasse laitière ou le beurre de cacao sous contrainte. En effet, Mazzanti a développé un système permettant d’induire une rotation dans le capillaire et d’étudier l’effet de la rotation sur les cristaux (Mazzanti et al., 2003; Mazzanti et al., 2004; Mazzanti et al., 2007).
Mais la Diffraction des Rayons X reste une technique relativement lourde à utiliser, et tout particulièrement avec les nouveaux appareils synchrotron, c’est pourquoi elle reste souvent une technique employée au laboratoire, et il est rare de la trouver dans le monde industriel.
3.2.4 Mesure de la taille des cristaux
Dès 1918, Scherrer découvrit qu’il existait une relation entre le pic de diffraction de
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régulièrement utilisée pour estimer la taille des cristaux. L’équation de Scherrer relie la largeur du pic de diffraction de poudre aux dimensions moyennes des cristaux selon :
( )θ λ θ
β
cos
2
T
K
s=
Avec : βs la contribution de la taille des cristaux à la largeur du pic de diffraction en radians, K est une constante adimensionnelle proche de l’unité dépendant de la méthode de détermination de la largeur du pic (intégral ou largeur à mi-hauteur), λ correspond à la longueur d’onde des rayons X et est une caractéristique de l’appareil, et T correspond à l’épaisseur moyenne du cristal dans une direction perpendiculaire au plan de diffraction. Ce dernier paramètre donne des informations sur une seule dimension du cristal.
Mazzanti utilisa ce modèle sur les cristaux de matière grasse (Mazzanti et al., 2005; Mazzanti et al., 2007; Mazzanti et al., 2008a). Il réussit grâce à ces mesures, combinées à des mesures de surface de pics de diffraction, à proposer un modèle de croissance des cristaux de matière grasse. Il est important de rappeler que les cristaux de triacylglycérols se développent selon une direction privilégie sous forme d’aiguilles ou de lamelles. Puisque l’épaisseur T est mesurée dans une seule dimension, il est important de bien choisir le plan de diffraction. En effet, des cristaux peuvent grossir dans un autre plan et leur croissance n’est pas détectée par la mesure de la diffraction des rayons X. Pour avoir véritablement une information juste sur la taille des cristaux en utilisant l’équation de Scherrer, il est nécessaire de faire tourner l’échantillon et ainsi de mesurer l’épaisseur moyenne dans toutes les dimensions. Une récente étude sur les limitations de l’utilisation de ce modèle et la justesse des résultats a été publiée sur des matériels poreux (Burton et al., 2009). Elle démontra que dans le cas de cristaux très grands ou pour des cristaux anisotropiques, l’utilisation de ce modèle conduisait à une sous-estimation de la taille réelle.