Diff´erences de m´ecanisme d’ouverture selon les esp`eces

Le m´ecanisme d’ouverture d´ecrit correspond `a celui du MscL de E. coli. Bien que la plupart des caract´eristiques puissent s’appliquer de la mˆeme mani`ere au canal de M. tuberculosis, cer- taines diff´erences existent entre les deux esp`eces.

Les substitutions dans la zone de constriction sont moins dramatiques chez M. tuberculosis que chez E. coli. Par exemple, la mutation de Ala 20 (analogue de G22) entraˆıne un ph´enotype normal (Ajouz et al. , 2000). La r´egion de constriction est pr´esente mais insuffisante pour ex-

4.4. M´ecanisme d’ouverture pliquer la barri`ere ´energ´etique qui doit ˆetre franchie pour ouvrir le canal. Une autre barri`ere pourrait exister : la liaison hydrog`ene entre R45 et Q51 pour laquelle aucun ´equivalent n’a ´et´e trouv´e pour E. coli (Moe et al. , 2000; Maurer et al. , 2000).

Nous avons vu que les h´elices agissaient comme des ressorts maintenant le canal ferm´e (sec- tion 4.4.8). La boucle p´eriplasmique pourrait donc permettre de g´erer le niveau de sensibilit´e du canal `a la tension (Ajouz et al. , 2000). La sensibilit´e du canal `a la tension est deux fois plus grande pour E. coli que pour M. tuberculosis (qui est donc deux fois plus dur `a ouvrir) (Sukharev et al. , 1999; Moe et al. , 2000) et les plus grandes diff´erences entre les deux ho- mologues sont observ´ees dans cette r´egion. De plus, la mutation de r´esidus impliqu´es dans des liaisons hydrog`enes de la boucle de M. tuberculosis r´esulte dans des ph´enotypes GOF (Gain Of

Function, c’est `a dire dont la sensibilit´e est plus grande) (Maurer et al. , 2000) mais aucune interaction analogue n’a pu ˆetre observ´ee pour E. coli. Ceci sugg`ere donc un m´ecanisme d’action de la boucle diff´erent entre les deux organismes.

Chapitre 5

Questions et objectif

Les connaissances actuelles sur le canal m´ecanosensible bact´erien de grande conductance MscL permettent une description sch´ematique de son m´ecanisme d’ouverture : i) augmentation de l’inclinaison des h´elices transmembranaires entraˆınant une diminution de la hauteur du canal dans la membrane, ii) ´elargissement du diam`etre global du canal. Mais comme nous l’avons vu pr´ec´edemment, de nombreux points restent encore controvers´es ou inconnus.

Exp´erimentalement, l’´etude des prot´eines membranaires est tr`es complexe. Elles sont difficiles d’acc`es et leur isolement est compliqu´e par le fait qu’elles s’aggr`egent lorsqu’elles sont sorties de leur milieu. De plus, elles forment souvent de gros complexes, posant des probl`emes techniques laborieux et coˆuteux.

Une alternative r´eside dans les m´ethodes in silico. La dynamique mol´eculaire est une approche par laquelle les interactions `a un niveau atomique et la mobilit´e des structures sont ´evalu´ees dans diff´erentes conditions. Etant purement th´eorique, cette approche n´ecessite un recoupement avec des r´esultats exp´erimentaux mais elle permet de les valider, de les pr´eciser ou d’apporter de nouvelles voies de recherche en proposant de nouvelles hypoth`eses. Toutefois, des limitations existent aussi pour cette approche. En raison de la taille des syst`emes simul´es et du temps n´ecessaire pour calculer une trajectoire, seuls des ph´enom`enes rapides (en g´en´eral, de l’ordre de la dizaine de nanosecondes) peuvent ˆetre observ´es. La mise en oeuvre de moyens d’acc´el´eration de la dynamique est alors n´ecessaire.

L’objectif de mon travail a consist´e `a ´etudier la dynamique du canal m´ecanosensible MscL au sein de diff´erentes bicouches lipidiques mod`eles et de comprendre les interactions permettant de transmettre l’information de la bicouche au canal ainsi que son m´ecanisme d’ouverture `a un niveau atomique, autrement dit le pourquoi et le comment de tels changements conformationnels. Au d´ebut de ce travail, beaucoup de donn´ees exp´erimentales, que ce soit d’´electrophysiologie, de mutag´en`ese ou de prot´eolyse avaient ´et´e effectu´ees sur le MscL de E. coli. Il ´etait donc im- portant d’effectuer les simulations sur une structure de ce canal, afin de pouvoir confronter les r´esultats obtenus aux r´esultats exp´erimentaux. La seconde structure cristallographique du canal de M. tuberculosis n’existait pas encore. Le mod`ele structural de Sukharev, construit `a partir de contraintes li´ees au mod`ele de m´ecanisme d’ouverture, ´etait assez ´eloign´e de la structure cristal-

Chapitre 5. Questions et objectif

lographique disponible alors, malgr´e une identit´e de s´equence significative. Le mod`ele structural construit par homologie au sein du laboratoire par H´el`ene Valadi´e semblait donc le meilleur mod`ele pour cette ´etude.

La premi`ere ´etape pour comprendre les interactions entre le canal et les lipides environnants ainsi que le m´ecanisme d’ouverture du canal a ´et´e d’´etudier les propri´et´es de dynamique du MscL dans des membranes d’´epaisseur variable. Ce travail ´etait fortement bas´e sur le fait qu’une diminution de l’´epaisseur membranaire permet d’obtenir un interm´ediaire structural le long du chemin d’ouverture, diminuant la barri`ere ´energ´etique d’activation. Nous avons effectivement r´eussi `a obtenir et caract´eriser cet interm´ediaire.

Sachant que le canal MscL de M. tuberculosis est deux fois plus difficile `a ouvrir que celui de

E. coli, la deuxi`eme ´etape ´etait de savoir si un tel interm´ediaire pouvait ˆetre retrouv´e pour le

MscL de M. tuberculosis et, le cas ´ech´eant, caract´eriser les diff´erences et ressemblances dans les interactions et m´ecanismes menant `a cette structure. Nous n’avons obtenu aucune structure correspondant `a un interm´ediaire lors de ces simulations et avons donc essay´e de comprendre ce qui expliquait cette diff´erence.

La troisi`eme et derni`ere ´etape consistait `a valider l’hypoth`ese selon laquelle cette diff´erence de sensibilit´e ´etait li´ee aux boucles p´eriplasmiques. Nous avons donc cr´e´e des canaux hybrides en ´echangeant leurs boucles et les avons ´etudi´es.

Les m´ethodes employ´ees et le d´etail de ces travaux sera pr´esent´e dans la suite de ce manuscrit. Dans la prochaine partie, je d´etaillerai donc les diff´erentes m´ethodes et outils utilis´es lors de cette ´etude.

Les r´esultats seront ensuite pr´esent´es en quatres chapitres : les deux premiers correspondant `a la premi`ere ´etape de ce travail, c’est `a dire la dynamique du MscL de E. coli dans diff´erentes membranes, pr´esent´e sous deux angles diff´erents : la dynamique des lipides et la dynamique du canal. Les deux autres chapitres correspondent aux deux autres ´etapes de ce travail : la diff´erence avec le MscL M. tuberculosis et les canaux hybrides issus de ces deux organismes. Dans chaque chapitre, les r´esultats seront analys´es et discut´es.

Deuxi`eme partie

Chapitre 6

Mod´elisation par homologie

La mod´elisation par homologie permet de construire la structure tridimentionnelle (3D) d’une prot´eine `a partir de sa s´equence. Elle est bas´ee sur le fait que les structures 3D sont mieux conserv´ees que les s´equences d’une esp`ece `a l’autre (Chothia & Lesk, 1986). Deux prot´eines ayant un taux d’identit´e suffisamment fort partagent donc des structures tridimensionnelles similaires. Si l’on dispose d’une prot´eine dont la structure est connue et dont la s´equence est proche de notre prot´eine d’int´erˆet (ou prot´eine “cible”), il est possible d’en mod´eliser la structure `a partir de l’alignement entre les deux s´equences.

Il existe plusieurs approches pour, partant d’un support, ´elaborer une structure. N´eanmoins, la plus efficace et la plus utilis´ee actuellement est celle propos´ee par Sali et al. (1995), qui se base sur la satisfaction de contraintes issues du support choisi.

Le principe de la m´ethode utilis´ee est r´esum´e dans la figure 6.1. La qualit´e de la structure d´epend de la qualit´e de la ou des structure(s) mod`ele(s) ainsi que de la qualit´e de l’alignement fourni.

Fig. 6.1: Sch´ematisation de la proc´edure de mod´elisation par homologie (Extrait de Fiser & Sali (2003)).

Les r´egions structurellement conserv´ees sont directement mod´elis´ees `a partir des coordonn´ees atomiques de la prot´eine connue. La difficult´e r´eside dans les zones d’insertion/d´el´etion et dans les boucles, tr`es flexibles. Afin d’explorer au mieux l’espace conformationnel, plusieurs mod`eles vont ˆetre g´en´er´es et class´es selon une fonction objectif. Cette fonction permet de juger si le

Chapitre 6. Mod´elisation par homologie

mod`ele satisfait correctement les contraintes impos´ees au syst`eme. Il s’agit en fait d’une com- binaison entre l’´energie interne de la prot´eine et l’´energie due aux contraintes impos´ees par la conformation du support. Les param`etres utilis´es pour calculer cette ´energie sont ceux de CHARMM (Brooks et al. , 1983). Plus sa valeur est faible, plus le mod`ele satisfait donc les contraintes impos´ees.

Nous avons utilis´e la mod´elisation par homologie afin de construire la structure d’un monom`ere de chacune des prot´eines hybrides constitu´ees de la boucle p´eriplasmique du MscL de E. coli avec le reste du canal de M. tuberculosis et vice-versa. Les alignements utilis´es sont donn´es dans la figure 6.2. Les structures s´electionn´ees seront d´etaill´ees dans le chapitre 14.

TbMscL_{H 10 ARGNIVDLAVAVVIGTAFTALVTKFTDDIIMPPLGLLIGGIDFKQFAVTLRDAQGDIPAV 69} EcoMscL_{H 13 -RGNVVDLAVGVIIGAAFGKIVSSLVASIITPLINRI--GVNAQSDVGILRIGIGGGQTI 69} TbMscL 10 ARGNIVDLAVAVVIGTAFTALVTKFTDSIITPLINRI--GVNAQSDVGILRIGIGGGQTI 67 EcoMscL _{13 -RGNVVDLAVGVIIGAAFGKIVSSLVADIIMPPLGLLIGGIDFKQFAVTLRDAQGDIPAV 71} TbMscL_{H 70 VMHYGVLLSAAINFFLIAFAVYFLVVLPYNTLRKKGE-VEQPGDT-QVVLLTEIR 122} EcoMscL_{H 70 DL--NVFIQNVFDFLIVAFAIFMAIKLINKLNRKKEEPAAAPAPTKEEVLLTEIR 123} TbMscL _{68 DL--NVLLSAAINFFLIAFAVYFLVVLPYNTLRKKGE-VEQPGDT-QVVLLTEIR 118} EcoMscL _{72 VMHYGVFIQNVFDFLIVAFAIFMAIKLINKLNRKKEEPAAAPAPTKEEVLLTEIR 127}

Fig. 6.2: Alignements utilis´es pour construire les prot´eines hybrides. En rouge, la s´equence provenant de E. coli, en noir celle de M. tuberculosis.

Les monom`eres ont ´et´e assembl´es par superposition aux monom`eres de la structure cristallo- graphique. Les chaˆınes lat´erales des structures mod´elis´ees ont ´et´e replac´ees grˆace au programme SCWRL (Canutescu et al. , 2003). Les mauvais contacts entre monom`eres ont ´et´e retir´es par minimisation d’´energie dans Gromacs.

Chapitre 7

M´ecanique mol´eculaire

7.1

Principe

La m´ecanique mol´eculaire a pour objectif d’approximer l’´energie d’une mol´ecule en appli- quant les lois de la m´ecanique (on parle de m´ethode empirique). Elle permet de calculer des pro- pri´et´es structurales et thermodynamiques associ´ees `a une ou plusieurs mol´ecule(s). Les atomes y sont repr´esent´es comme des masses ponctuelles charg´ees. L’´energie potentielle est en g´en´eral exprim´ee comme une somme de contributions internes, entre atomes li´es chimiquement, et ex- ternes, entre atomes non li´es.