Différents vecteurs pour le transfert de gènes

Le transfert d'ADN dans les cellules en culture, destinées à être réimplantées, doit être très efficace pour limiter au maximum les opérations de sélection des cellules modifiées. En effet, ces opérations risquent de modifier les caractéristiques des cellules, et notamment leurs propriétés d'auto renouvellement et de différenciation nécessaires au bon fonctionnement de l'autogreffe de cellules génétiquement modifiées. De nombreuses méthodes permettant de transférer de l'ADN dans les cellules ont été décrites. Il s'agit soit de méthodes dites non virales, soit de méthodes virales.

La transfection utilise, pour transférer l'ADN étranger dans les cellules hôtes, des méthodes chimiques, comme la co-précipitation au phosphate de calcium, ou l'utilisation de complexes variés de l'ADN avec des vésicules lipidiques (liposomes) ou des protéines (protéosomes). Cependant, l'efficacité du transfert d'ADN par transfection est à ce jour très faible.

La transduction utilise pour le transfert d'ADN des virus comme les rétrovirus (dont les lentivirus), les adénovirus, les virus associés à l'adénovirus (AAV) (tableau 2).[33]

Tableau 2 propriétés des différents vecteurs viraux [33]

VECTEUR VIRAUX ^SPECIFITE

CELLULAIRE LOCALISATION SUBE-CELLULAIRE TAILLE MAXIMALE DE LINSERT Retrovirus Adenovirus Lentivirus Large cellules en division Très large

Très large (si pseudo typé par l’enveloppe du VSV-G) Intégration au hasard dans l ADN chromosomique Intégration en un site privilégié de L ADN chromosomique ou extra chromosomique Intégration au hasard dans l ADN chromosomique 7-7.5KB +/- 30KB 3.5-4KB 7-7.5KB

Les méthodes de transfert viral, et notamment rétroviral, sont actuellement beaucoup plus efficaces que les méthodes de transfert non viral.Les rétrovirus recombinants classiques, dérivant du génome du virus de la leucémie murine de Moloney (MoMuLV), permettent d'infecter avec une bonne efficacité une très grande variété de cellules en culture. Ils sont capables d'intégrer très efficacement leur matériel génétique dans le génome des cellules cibles en y constituant un « provirus » de structure bien définie et stable (figure 2 ).[33]

Figure 2. Principe du transfert de gènes à l'aide de rétrovirus recombinants.[33]

Le vecteur rétroviral porte le gène thérapeutique et une séquence d'encapsidation psy. Lorsqu'il est introduit dans les cellules trans-complémentantes contenant le provirus MoMLV dépourvu de sa séquence psy, une lignée productrice est établie. Les particules rétrovirales produites sont capables d'infecter les cellules cibles et d'y intégrer leur génome, mais ne sont pas capables de réplication. Le tropisme du vecteur rétroviral recombinant est déterminé par les glycoprotéines d'enveloppe codées par le gène env. Ces glycoprotéines se fixent à des récepteurs spécifiques membranaires nécessaires à l'entrée du rétrovirus dans la cellule.[33]

La modification génétique est donc transmise aux cellules dérivant des cellules initialement transduites et elle devient permanente si on réussit à modifier les cellules souches d'un tissu [ 28]. L'enveloppe amphotrope des vecteurs rétroviraux provenant du virus de Moloney peut être aujourd'hui remplacée par celle du virus de la leucémie du gibbon (GALV), ce qui améliore l'efficacité de transduction. Cette amélioration serait due à un niveau d'expression plus fort à la surface des cellules souches hématopoïétiques du récepteur utilisé par le GALV comparé à celui du virus amphotrope de Moloney.

La limitation principale de ce type de vecteur est la nécessité d'une division de la cellule cible pour obtenir une intégration chromosomique. Or la grande majorité des cellules souches sont quiescentes. Il est donc nécessaire de les mettre en cycle. De nombreuses études ont pour objet de trouver la combinaison de facteurs de croissances (interleukine 3, stem cell factor, flt3-ligand, thrombopoïétine...), permettant une prolifération des cellules souches sanguines sans provoquer une différenciation terminale avec perte de la totipotence cellulaire.

À ce jour, plus de 80 % des 350 protocoles cliniques de thérapie génique acceptés ont pour principe la transduction, avec une majorité utilisant la transduction rétrovirale. La liste des protocoles cliniques est régulièrement mise à jour dans la revue Human Gene Therapy.

Les adénovirus recombinants restent dans le cytoplasme de la cellule en position extrachromosomique et le transgène est en général perdu par effet de dilution au cours des divisions cellulaires successives. Ils peuvent conduire à une réaction immune de rejet par l'organisme hôte. En revanche, les avantages des vecteurs adénoviraux, par rapport aux rétrovirus, sont d'une part leur grande stabilité et leur titre très élevé, et d'autre part leur capacité à infecter les cellules qui ne se divisent pas. Aussi, leur utilisation est appelée à se développer dans le cadre de la thérapie génique anticancer [29].

Le virus associé à l'adénovirus (AAV) est un parvovirus non pathogène nécessitant l'adénovirus comme auxiliaire pour sa réplication. L'intérêt de ce vecteur réside dans le fait qu'il peut infecter des cellules qui ne se divisent pas. Cependant, si l'expression transitoire est très efficace, l'intégration chromosomique reste faible et l'expression d'un gène fonctionnel décline progressivement au cours des divisions cellulaires.

L'avenir des vecteurs viraux s'oriente d'une part vers les systèmes d'expression à plusieurs gènes (figure 3 )[33] et d'autre part vers les vecteurs lentiviraux qui combinent les avantages respectifs des rétrovirus classiques (intégration dans le génome) et des adénovirus (infection des cellules quiescentes). Le remplacement de l'enveloppe du lentivirus par la glycoprotéine d'enveloppe du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV-G) confère à ce type de vecteur un tropisme très large et une stabilité de la particule permettant une concentration des rétrovirus par ultracentrifugation [ 30,31 ].

Figure 3 . Les différents types de vecteurs rétroviraux.[33]

On distingue les vecteurs à LTR (longue répétition terminale) et les vecteurs à promoteurs internes. Pour les vecteurs à LTR, la transcription du transgène est sous la dépendance des signaux transcriptionnels du LTR en 5'. Dans les vecteurs à « promoteur interne », l'expression d'un ADNc transféré est sous la dépendance d'un promoteur hétérologue (d'origine virale ou cellulaire). Le promoteur interne peut être en orientation inverse pour limiter les interférences avec le promoteur LTR 5' rétroviral. Pour les constructions à deux gènes, l'expression des deux gènes peut être sous la dépendance : soit d'un seul promoteur LTR en 5', le deuxième gène étant en aval d'un site accepteur d'épissage ou sous des séquences internes d'entrée des ribosomes (IRES), soit de deux promoteurs, par exemple un LTR 5' et un promoteur interne. Le sens des flèches correspond au sens de la transcription. [33]

p. int : promoteur interne

SD, SA : sites donneurs et accepteurs d'épissage ; IRES : séquences internes d'entrée des ribosomes.