2.1.1- Prélèvement
La qualité du prélèvement conditionne le bon résultat. D’où des contraintes de : Asepsie : respect des conditions de stérilité.
Méthodes : - Prélèvement superficiel : (seringue, curette, biopsie). Il faut noter que l’écouvillon à déconseiller sauf pour téguments et muqueuses.
- Prélèvement profond : jamais à l’écouvillon.
Transport : plus rapide possible < 30 min pour LCR, liquides de ponction, prélèvement peropératoires, sinon utilisation de milieux de transport.
Conservation : Dépend de la nature du prélèvement et de la nature du germe suspectée.
2.1.1.1- Hémocultures : [98]
Ils permettent le diagnostic des bactériémies et constituent un examen obligatoire et indispensable chez tout neutropénique fébrile [134].
- Elles doivent être, si possible, prélevées avant le début du traitement antibiotique. - Deux jeux de flacons par épisode infectieux sont habituellement suffisants.
- En cas de suspicion d’infection sur cathéter, les hémocultures seront prélevées simultanément à son niveau et à celui d’une veine périphérique.
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Le diagnostic des infections sur cathéter est d’une importance capitale en raison de la fréquence de ces dispositifs chez les patients neutropéniques [138,140].
Les méthodes classiques qui sont fondées sur la culture semiquantitative de l’extrémité du cathéter présentent l’inconvénient majeur d’entrainer le retrait d’un cathéter qui peut ne pas être infecté.
Un certain nombre de méthodes ont récemment été développées pour permettre le diagnostic d’infection sur un cathéter laissé en place [138,140].
La première est fondée sur la différence du temps de positivité (DTP) observée entre des hémocultures prélevées au cathéter et en périphérie [138,139]. Cette méthode nécessite que les deux hémocultures soient prélevées au même moment, mises à incuber dans un automate qui assure une surveillance permanente de la croissance bactérienne et permet la détermination précise des temps respectifs de positivité.
La deuxième méthode consiste à prélever au niveau du cathéter quelques millilitres de sang qui sont cytocentrifugés sur une lame et colorés soit par la méthode de Gram, soit par de l’acridine orange. [140] Cette dernière technique semble être plus sensible et plus spécifique que les techniques classiques qui nécessitent le retrait du cathéter [140].
2.1.1.2- Prélèvements urinaires :
L’examen cytobactériologique des urines (ECBU) permettra de faire le diagnostic d’une infection urinaire, porte d’entrée éventuelle d’une septicémie.
2.1.1.3- Coprocultures : [98]
Deux types de résultats en fonction du contexte clinique sont attendus à partir de l’analyse bactériologique des selles chez les patients neutropéniques. Cet examen permet d’une part la recherche de bactéries entéropathogènes habituelles (Salmonella,
Shigella,Yersinia, Campylobacter). La quantification de la coproculture chez les patients
recevant une décontamination digestive, associée ou non à une antibioprophylaxie, permet d’autre part d’apprécier le degré de colonisation du patient par des bactéries susceptibles de transloquer et d’en déterminer la sensibilité aux antibiotiques.
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2.1.1.4- Prélèvements d’origine respiratoire : [98]
En cas d’atteinte pulmonaire, il a été démontré que la stratégie diagnostique non invasive (examen cytobactériologique des crachats, crachat dirigé pour pneumocystis) en réanimation n'était pas inférieur à la stratégie de lavage broncho-alvéolaire(LBA).
2.1.1.5- Examen cytobactériologique du liquide céphalorachidien (LCR) :
Les infections du système nerveux central sont rares chez les neutropéniques et souvent difficiles à diagnostiquer.
2.1.1.6- Prélèvements d’origines diverses
Ces prélèvements (ponctions, fragments biopsiques) souvent précieux doivent bénéficier de la plus grande attention.
Un écoulement persistant ou chronique est également prélevé et mis en culture à la recherche de champignons ou de mycobactéries atypiques.
Les ulcères des muqueuses sont tamponnés et cultivés à la recherche de virus de l'herpès.
Les lésions cutanées sont ponctionnées ou biopsiées pour une analyse cytologique et une mise en culture [143].
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Tableau X: Prélèvements en microbiologie clinique [144]
Prélèvement Précaution Matériel Transport/Conservation Urines -1ère miction matinale ou 4h après
toute miction
-Après nettoyage soigneux -Elimination du 1er jet -Flacon stérile -Poche stérile (nourrisson) -Seringue (sonde) -1h à Température ambiante quelques heures à +4° Vaginal Endocervical
-Pas de toilette intime 24h avant le prélèvement. -Grattage de l’endocol (mycoplasme+chlamydia) -Spéculum -Ecouvillons : -cytobrosse : chlamydia -1h à Température ambiante
Urétral -avant la 1ère miction matinale ou : 3 à 4 h après miction
-grattage des muqueuses : mycoplasme + chlamydia -Ecouvillons : -2fins -1 mycoplasme -1 chlamydia +1er jet urinaire -1h à Température ambiante
Sperme -Abstinence pendant 3 jours. -Nettoyage soigneux
-Uriner avant le prélèvement
-flacon stérile 1h à 37°
Pus superficiel -vaccinostyle
- 2 écouvillons +1/2 pour anaérobie.
1h à Température ambiante
Pus profond -Chasser l’air de la seringue + Fermeture hermétique -Désinfectant -Seringue -écouvillons (aérobie et anaérobie) en cas d’accès chirurgical -Température ambiante -Transport immédiat
Hémoculture -Désinfection (peau, flacon, prélèvement)
-Pic thermique (hypothermie) -Date et heure du prélèvement.
-2 flacons (aérobie et anaérobie)
-à 37° ¼ h après prélèvement.
LCR -Désinfection, date et heure du prélèvement -Tube stérile -à 37° -Transport immédiat Liquide des séreuses Pleural, articulaire, péritonéal, ascite, péricardique
-Désinfection (prélèvement + peau) -façon stérile -tube + anticoagulant (Ex direct) -1 seringue + aiguille stérile. -Transport immédiat -Température ambiante
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2.1.2- Examen macroscopique [144]
Toute infection bactérienne s'accompagne, outre la présence de bactéries, de signes biologiques liés à l'inflammation avec l'éventuelle présence de leucocytes, notamment de polynucléaires.
Ces éléments peuvent entrainer au-delà d'un seuil, une modification visuelle, clairement perceptible à l'œil nu, qui signe une anomalie patente :
-Trouble et hématurique : urine, LCR, liquide pleural ou articulaire. -Odeur : infections à germes Anaérobies.
-Consistance : selle diarrhéique.
2.1.3- Examen microscopique [144]
L'examen microscopique a un intérêt diagnostique au-delà d'un certain seuil. Donc souvent, on notera aucune anomalie macroscopique ou visible à l’ œil nu, d'où la nécessité de rechercher des bactéries et des éléments cellulaires de type polynucléaire au microscope optique.
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2.1.3.1- Examen à l’état frais :
Une préparation est obtenue avec le dépôt d’une goutte entre lame et lamelles, puis on observe au microscope optique.
Cet examen permet d’:
- Observer la morphologie et la mobilité des bactéries éventuelles (coque, diplocoque, chaînette, coccobacille, bacille).
- Evaluer les cellules avec une appréciation semi-quantitative (rares, peu nombreux, très nombreux) ou mieux quantitativement, exprimée par nombre d’éléments/mm3 ou ml.
- Distinguer les cellules d’accompagnement : soit des polynucléaires ou des lymphocytes (étude qualitative et quantitative).
2.1.3.2- Examen après colorations:
La coloration de Gram met en évidence des bactéries , leurs morphologies, leurs position intra ou extracellulaire , en cas de pus polymicrobien, l’espèce dominante et leurs abondance (Entérobactéries, Staphylocoques..).
La coloration au bleu de methylène permet de confirmer les résultats de l’examen à l’état frais ( nature des éléments cellulaires, leur état et le calcul de leur pourcentage).
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2.1.4- Culture et isolement
La qualité des milieux de cultures, l’adjonction de résines chélatrices des antibiotiques présente dans les milieux récents et la surveillance en temps réel de la croissance bactérienne à l’aide d’automates permettent la détection de la quasi-totalité des micro-organismes [135].
En cas de suspicion d’une bactérie à croissance lente et/ou difficile, le temps d’incubation, habituellement de 5 jours, sera allongé à 15 jours et des repiquages systématiques des différents flacons prélevés pourront être réalisés.
À l’heure actuelle, les SCN sont parmi les premiers germes responsables de bactériémies nosocomiales et représentent à peu près 50 % des isolats d’hémocultures chez les patients neutropéniques [100,101].
Des techniques qui permettent la croissance de bactéries à paroi déficiente qui seraient responsables de bactériémies à hémocultures négatives ont été proposées [136,137].
L’ensemencement sur des milieux sélectifs permet le dépistage de bactéries multirésistantes (entérobactéries productrices de β-lactamase à spectre étendu ou de céphalosporinases déréprimées, entérocoques résistants aux glycopeptides).
L’intérêt de la surveillance systématique de la flore digestive chez les patients neutropéniques reste controversé en fonction des équipes [141,142].
La sensibilité des hémocultures, évaluée à 50 % dans des études anciennes, a probablement été augmentée, ces dernières années, par l’amélioration des automates et des milieux de culture, pour permettre une détection de plus de 90 % des candidémies en moins de 48 heures [145]. Les cultures sur milieu aérobic « tous germes >> ont une sensibilité de 80 à 92 % avec un délai de positivité de 1,8 à 5 jours [146]. L’utilisation de milieux << spécial fongique >>, contenant des antibiotiques pour inhiber la croissance de batteries parfois associés, semble intéressante chez le patient neutropénique qui présente plus fréquemment des infections << mixtes >> (bactéries /levures) [147]. Ces milieux semblent permettre une diminution du délai de positivité et d’identification de l’espèce et une meilleure détection de certains Candida (glabrata) [148].
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2.1.5- Identification phénotypiques
L’étude microscopique (l’état frais et la coloration) et des caractères culturaux (morphologies, durée, conditions physiologique) constituent les étapes de l’identification des espèces ; parfois ces méthodes sont insuffisantes d’où l’intérêt de l’étude antigénique.
Et ceci soit par l’étude des antigènes de groupe ou de type portés par la bactérie à l’aide de sérums spécifiques connus (exemple sérogroupage du Pseudomonas .spp), soit par des réactions immunologiques d’agglutination ou de précipitation de l’antigène bactérien par l’antisérum spécifique connu (exemple : Staphylococcus aureus).
2.1.6- Antibiogramme
Les SCN sont en général multirésistants, notamment à la méticilline, aux aminosides, aux fluoroquinolones, et peuvent présenter une sensibilité diminuée aux glycopeptides [103].
Les streptocoques viridans sont le plus souvent sensibles aux antibiotiques actifs sur les bactéries à Gram positif. Cependant, on assiste à une augmentation progressive de l’incidence de souches de sensibilité diminuée aux β-lactamines qui sont également résistantes aux macrolides et apparentés (lincosamides-streptogramines) et aux tétracyclines. Des souches avec un haut niveau de résistance à l’amikacine ne sont pas exceptionnelles, à l’inverse de celles qui possèdent un haut niveau résistance à la gentamicine [107,108].Toutes les souches isolées sont encore à l’heure actuelle sensibles aux glycopeptides. Cependant, les descriptions récentes de souches de streptocoques résistantes à la vancomycine, apparentées au groupe bovis, [109] font craindre la dissémination de ces caractères de résistance chez les
streptocoques viridans ou d’autres espèces de streptocoques comme les pneumocoques.
Depuis une quinzaine d’années sont apparues des souches d’entérocoques mulirésistantes aux antibiotiques β-lactamines, haut niveau de résistance à la gentamicine, y compris aux glycopeptides : vancomycine et téicoplanine [112]. Des épidémies d’infections nosocomiales dues à ces entérocoques résistants à la vancomycine (ERV) ont été rapportées chez des patients neutropéniques. Dans la majorité des cas, les rares bactériémies à ERV surviennent chez des patients ayant une colonisation fécale importante et le mauvais pronostic vital rapporté pour ces infections est lié avant tout à la fragilité du terrain sous-jacent plus qu’à des facteurs de virulence spécifiques de ces bactéries [110,111].
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L’émergence des ERV en pathologie humaine pose de réels problèmes.
-Les premiers sont d’ordre thérapeutique puisque des souches résistantes à tous les antibiotiques disponibles ont été décrites [110,111].
- Les seconds sont d’ordre épidémiologique car les gènes qui confèrent ces résistances sont localisés sur des éléments génétiques mobiles de type plasmide ou transposon [113].
Les pathogènes émergents à gram positif sont naturellement résistantes à de nombreux antibiotiques et sont généralement sélectionnées par des antibiothérapies à large spectre. Ces micro-organismes, qui sont souvent d’identification difficile, doivent impérativement être reconnus car ils nécessitent une antibiothérapie appropriée.
Actuellement, l’un des problèmes majeurs d’antibiorésistance chez les souches d’E.coli concerne l’augmentation de l’incidence de la résistance aux fluoroquinolones. Quasiment absente jusqu’au milieu des années 1990, elle varie de 5 % à plus de 25 % des souches isolées en fonction des centres étudiés [114,115]. Une cause probable de l’augmentation de ce taux de résistance est l’utilisation croissante de ces antibiotiques à des fins prophylactiques ou thérapeutiques [116,117].
Les pathogènes émergents à Gram négatif sont souvent naturellement résistantes aux antibiotiques [98].
2.1.7- Biologie moléculaire
En cas de forte suspicion d’infection bactérienne, si les cultures restent négatives dans les conditions précitées, les techniques de biologie moléculaire présentent un grand intérêt et permettront, dans certains cas, l’identification de l’agent pathogène responsable [136,137].
La détection des germes se fait soit directement à partir des prélèvements par amplification des gènes codant pour les ARNr 16S (par exemple détection des agents de méningites communautaires sur LCR : N. meningitidis, L.monocytogenes, S. pneumoniae, H.
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La sensibilité aux antibiotiques peut être également déterminée par les techniques de biologies moléculaire c’est le cas de la résistance des Staphylocoque aureus à la Méthicilline (SARM).
Figure 16: Appareil de PCR et la révélation UV d'un produit amplifié après électrophorèse sur gel [144]
2.1.8- Interprétation et validation
La lecture et l’interprétation des résultats doit tenir compte du type de prélèvement (mono ou poly microbien), du malade, de l’histoire clinique et du contexte épidémiologique. Le diagnostic de certitude est bactériologique.
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Figure 17: Algorithme du diagnostic bactériologique direct [144]