Diagnostique biologique :

Bien que les lésions herpétiques au niveau de l’appareil génital sont généralement évocatrices, mais le recours à une confirmation microbiologique semble nécessaire.

On distingue deux types d’examen microbiologique pour le diagnostic de l’herpès Direct et indirect

1. Prélèvement

Le prélèvement, doit être réalisé par des praticiens expérimentés, en dehors de toute désinfection ou de traitement antiviral. La qualité des résultats dépend particulièrement de la technique du prélèvement et de sa conservation.

Dans la forme typique, le prélèvement porte sur des lésions fraiches, ou le liquide vésiculaire et les cellules du plancher des vésicules

Le liquide vésiculaire est recueilli à l’aide d’un écouvillon, et par un deuxième écouvillon on prélève les cellules du plancher par rotation ferme, sans faire saigner la lésion, pour rechercher l’ADN du virus et de l’isoler en culture cellulaire [18].

En cas d’infection asymptomatique, un large écouvillonnage portera sur la surface de la muqueuse avec recueille des sécrétions.

Chez la femme enceinte, l’écouvillonnage se fera à deux niveaux : faces interne, externe des petites lèvres et col utérin : après avoir éliminé, à l'aide d'un écouvillon le bouchon muqueux du canal cervical, un deuxième écouvillon est introduit sur 1 ou 2 cm dans le canal cervical, tourné dans ce canal puis passé à la surface du col utérin, puis exprimé dans un tube de milieu de transport. Un troisième écouvillon est passé sur les faces interne et externe des petites lèvres pour être exprimé dans le même tube que l'écouvillon précédent [18, 75].

Le prélèvement doit être mis par la suite dans un milieu de transport spécifique contenant des antibiotiques et des protéines pour éviter la dégradation des virions et faussement des résultats [68, 76, 77]. Les prélèvements peuvent être conservés dans le milieu de transport entre + 4°C et 8°C jusqu’à 36 heures [78].

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Le délai de transport au laboratoire doit être court, entre 2 et 4 heures pour avoir de meilleurs résultats, et il ne doit pas contenir trop de volume afin de minimiser l’effet de dilution qui pourrait diminuer la sensibilité de l’isolement ou de la détection d’antigène [68, 76, 77].

Différents milieux de transport sont commercialisés, entre autres : ENEM, solutions saines type solution de Hank’s [79].

2. Techniques de diagnostic

2.1. Diagnostique direct

2.1.1. Détection antigénique

La détection antigénique se fait par immunofluorescence ou par la méthode ELISA à l’aide de tests commercialisés.

2.1.1.1. Révélation par immunofluorescence

Effectuée sur un frottis des cellules de la base de la vésicule herpétique ou sur le culot cellulaire obtenu après centrifugation du prélèvement déchargé dans le milieu de transport.

Après fixation avec l’acétone refroidie, les anticorps monoclonaux sont déposés sur le frottis. Après incubation et lavage, le conjugué marqué à la fluorescéine permet de révéler la réaction.

La lecture au microscope à ultrat violets montre une inclusion nucléaire fluorescente au stade précoce de l’infection et une fluorescence diffuse dans toute la cellule au stade tardif de l’infection.

C’est un test simple et rapide (1 à 2 heures), dont la sensibilité varie entre 74 et 100 % selon les auteurs par rapport à la technique de culture.

Le résultat est interprétable que si le nombre de cellules prélevées est supérieur à 20. C’est une technique inadaptée au dépistage d’infection asymptomatique [78].

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2.1.1.2. Détection d’antigènes par technique immuno-enzymatique ELISA :

Au moyen d’anticorps immun fluorescents, le principe est basé sur une immune capture de l’antigène viral par des anticorps fixés sur une plaque de polystyrène.

En cas de présence de l’antigène dans le prélèvement, celui-ci va se fixer. Un deuxième anticorps marqué avec une enzyme vient s’accrocher. Après lavage, lorsqu’on ajoute le substrat de l’enzyme, il se produit une réaction colorée [51].

C’est un Test direct et rapide (délai 5 heures), mais qui ne permet pas la distinction de type [79, 80].

Il est réalisable sur des liquides de vésicules, mais non adaptées au dépistage des infections asymptomatiques.

2.1.2-Détection du génome par PCR

Les techniques d’amplification génique sont de plus en plus utilisées pour le diagnostic des infections herpétiques.

Plusieurs gènes peuvent être amplifiés, le gène de l’ADN pol, de la TK ou des glycoprotéines gB, gD et gG.

La PCR est remarquablement sensible, 3 à 4 fois plus que l’isolement par inoculation à des cellules en culture pour déceler une sécrétion génitale asymptomatique.

Elle révèle la présence de séquences génomiques virales dans les cellules étudiées permettant la détection du virus en très faible quantité dans un tissu suspect [47].

C’est une technique rapide ne nécessitant pas des conditions spéciales de transport et de conservation [81]. Les résultats peuvent être obtenus dans les deux heures qui suivent le prélèvement [80].

La PCR s’avère la méthode de choix surtout pour le diagnostic d'encéphalite et de méningite herpétique, elle présente aussi son intérêt dans le diagnostic de l’herpès néonatal et dans les lésions atypiques et les infections asymptomatiques [47, 78, 80-83].

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Elle persiste positive 5 jours puis devienne négative après la mise sous acyclovir et permet de débuter le traitement sans attente. Mais expose pour autant au risque de faux positifs par contamination ou faux négatifs par inhibiteur de la réaction d’amplification [67].

Cependant, positive, elle ne signifie pas obligatoirement que le prélèvement contient du virus infectieux, la relation entre quantité d’ADN viral appréciée par PCR en temps réel et contagiosité n’ayant pas été établie [26].

2.1.3 Culture cellulaire

L’isolement du virus en culture cellulaire constitue la méthode de référence du diagnostic d’herpès, mais actuellement les techniques d’amplification génique PCR sont plus largement utilisée [84].

Sa sensibilité atteint 77% en primo-infection et diminue pendant les récurrences où il y a moins de charge virale ainsi qu’une période d’excrétion virale plus courte [85, 86].

L’herpès simplex virus est cultivable sur un grand nombre de cellules. Les plus couramment utilisées sont les cellules diploïdes de fibroblastes humains MRC5.

Après filtration du prélèvement, le liquide filtré est mis en culture dans des boites contenant les cellules (MRC5) et incubées à 37°C.

L’effet cytopathogénique très évocateur d’une infection herpétique, est celui des cellules bien rondes en foyer dites en grappe de raisin. (Figure 20)

Le délai d’apparition de l’effet cytopathogène varie entre 24 heures et 15 jours. Il dépend de la quantité de virus présente dans les lésions [77, 78, 80, 81].

Les souches d’HSV2 donnent souvent quelques syncytiums à deux ou trois noyaux.

En coloration, le noyau est hypertrophié, occupé par une vaste inclusion éosinophile.

Grâce à l’immunofluorescence et l’immuno-peroxydase, La culture virale permet aussi l’identification du type viral HSV -1 ou 2 et l’isolement de la souche en vue de réaliser un virogramme et tester la sensibilité aux antiviraux surtout en cas d’herpès récurrent résistant cliniquement au traitement antiviral [82, 85].

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Figure 20 effet cytopathogénique de l’herpès simplex virus[26]

2.1.4 Cytodiagnostic de Tzanck

Il s’agit d’un examen cytologique permettant de visualiser après coloration, des lésions cellulaires dues aux herpes virus. Il est réalisé sur un frottis obtenu par un raclage à partir d'un prélèvement au vaccinostyle de cellules infectées du plancher d'une ulcération, ou mieux, d'une lésion vésiculeuse après avoir enlevé le toit de la lésion.

Ces lésions se traduisent par la présence d’inclusions nucléaires éosinophiles entourées d’un halo clair avec une margination de la chromatine au niveau de la membrane nucléaire.

Après coloration de MayGrünwald-Giemsa, l'effet cytopathogène du virus est visualisé au microscope optique : présence de cellules ballonnées de grande taille et multi-nucléées avec un noyau bourgeonnant.

C’est une méthode simple et peu couteuse mais peu sensible, elle est de moins en moins utilisée en pratique courante. [78]

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