III-2-1-1. Prélèvement
Le prélèvement est une étape cruciale dans le diagnostic des candidoses systémiques, car de sa qualité dépend la fiabilité des résultats. Il doit être réalisé avant tout traitement antifongique et en quantité suffisante.
III-2-1-2. Examen direct
Il se fait directement entre lame et lamelle et observé au microscope optique.
L’espèce Candida apparaît sous forme de petites levures à paroi mince, arrondies ou ovales, bourgeonnantes, de 1 à 10 µm, non capsulées (différence avec le Cryptocoque), accompagnées ou non de pseudofilaments ou filaments mycéliens. La détection de pseudofilaments à l’examen direct est un signe de pathogénicité (figures 5 et 6).
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Figure 5 . Examen direct : aspect de blastospores, grossissement x 40
[Photo du service de Parasitologie Mycologie, Hôpital Militaire d’Instruction Mohammed V, Rabat]
Figure 6. Examen direct : aspect de blastospores et filaments mycéliens, grossissement x 40
30 III-2-1-3. Culture
Elle est indispensable puisqu’elle permet :
● l’augmentation de la sensibilité de l’examen direct ; ● l’identification de la levure en cause ;
● la numération des levures nécessaire à l’interprétation des résultats ; ● la réalisation de l’antifongigramme.
L’ensemencement se fait habituellement sur milieu Sabouraud chloramphénicol–actidione, en plus du milieu Sabouraud– chloramphénicol.
L’incubation se fait à 37 °C. La lecture se fait au bout de 24 à 48 heures
[15,79]. L’examen macroscopique des cultures montrera des colonies blanches
et humides (figure 7). Leur examen microscopique mettra en évidence des levures bourgeonnantes.
Figure 7. Aspect des colonies de C. albicans sur milieu Sabouraud [Photo du service de Parasitologie Mycologie, Hôpital Militaire d’Instruction Mohammed V, Rabat]
31 L’hémoculture qui est un examen clé dans le diagnostic des candidoses systémiques reste de sensibilité faible (40 à 60 %) malgré le développement des systèmes récents pour améliorer la sensibilité des hémocultures (système Isolator [lyse–centrifugation], automates). Ceci implique qu’une hémoculture négative n’élimine pas le diagnostic d’une candidose systémique. Cependant, une seule hémoculture positive confirme le diagnostic [57, 60,119].
Par ailleurs, la supériorité des automates d’hémoculture sur les systèmes manuels n’est plus à démontrer. On distingue les automates Bactec system (Becton-Dickinson) et BacT/Alert system (BioMérieux).
De nombreuses études ont évalué ces automates en utilisant différents milieux : BacT/Alert FanAerobic, Plus Aerobic/F, Mycosis IC/F [53,58].
Les résultats montrent une supériorité des milieux BacT/Alert sur les milieux Plus Aerobic/F.
Mycosis IC/F qui est un milieu spécifique pour les champignons est plus efficace que les deux milieux précédents. En effet, Il est plus sensible et plus précoce pour le diagnostic des candidoses systémiques, particulièrement quand il s’agit des espèces C. albicans et C. glabrata qui représentent 70 % des espèces incriminées et quand il y a présence concomitante des levures et des bactéries. Cette association est commune représentant 18 à 21 % des fongémies
32 III-2-1-4. Culture sur milieu sélectif
Les milieux chromogéniques fournissent des résultats plus précis et plus rapides. Ils permettent le diagnostic sélectif des colonies de Candida albicans, Candida tropicalis, Candida krusei et Candida glabrata directement sans avoir recours à des galeries d’identification, ces espèces étant les plus incriminées dans les candidoses systémiques. Ils permettent également la mise en évidence des associations d’espèces ce qui est impossible avec le milieu de Sabouraud.
Ces milieux chromogéniques contiennent des nutriments permettant la croissance des levures, des antibiotiques afin d’inhiber la pousse des bactéries et des substrats chromogéniques permettant la mise en évidence d’enzymes spécifiques à certaines levures. La différenciation est basée sur l’apparition de coloration spécifique de chaque espèce après hydrolyse de l’enzyme correspondante. Ces milieux permettent ainsi l’identification présomptive de C.albicans, C.tropicalis, C.glabrata et C.krusei.
Différents kits sont commercialisés notamment le Candi Select4®, le Chromagar Candida® et l’Albicans ID®. Le kit utilisé au laboratoire de Parasitologie de l’Hôpital Militaire Mohammed V est le Candi Select4®.
Après ensemencement des milieux de cultures, les boites de pétri sont incubées à 35°C pendant 48 heures [15, 79].
33 III-2-1-5. Identification
L’identification sur le milieu Candi Select4® est aisée, c’est un test qui permet de faire le diagnostic de C.albicans dont les colonies apparaissent roses à violettes. Pour les autres espèces, l’identification est présomptive. Le C.tropicalis apparaît sous forme de colonies de couleur turquoise très intense, à contours réguliers et à morphologie lisse. Les colonies de C.glabrata sont turquoises brillantes, plates, à contours réguliers et à morphologie lisse. Les colonies de C.krusei sont turquoises, d’aspect sec, à contour réguliers et à morphologie rugueuse. Les autres espèces de Candida sont de couleurs blanchâtres et à morphologie lisse, elles nécessitent une identification par galeries biochimiques.
L’identification dans certains cas repose également sur les caractères physiologiques et immunologiques.
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Figure 8. Milieu Candi Select4® : [Photo du service de Parasitologie Mycologie, Hôpital Militaire d’Instruction Mohammed V, Rabat]
- Colonies violettes : C.albicans, ne pas faire de galerie d’identification.
- Colonies turquoises intenses, bombées, contour régulier : C.tropicalis, ne pas faire de galerie d’identification.
- Colonies turquoises, plates, contour régulier : C.glabrata, ne pas faire de galerie d’identification, confirmer par le RTT Glabrata. (figure 9)
- Colonies turquoises, aspect sec, contour irrégulier : C.krusei, ne pas faire de galerie d’identification, confirmer par le krusei-color (figure 10)
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RTT glabrata® [5]
L’hydrolyse du tréhalose en glucose par C.glabrata est un caractère biochimique qui est exploité dans ce test. La révélation de cette production de glucose permet alors l’identification de la levure. Un test positif est caractérisé par une coloration marron orange, un test négatif est caractérisé par l’absence de coloration. Seul C.glabrata donne un résultat tréhalase positif et maltase négatif.
Figure 9 : RTT Glabrata® ; principe du test: [Photo du service de ParasitologieMycologie, Hôpital Militaire d’Instruction Mohammed V, Rabat]
+ -
Ininterprétable Non C.glabrata
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Krusei color Fumouze® [38,97].
Ce test repose sur l’agglutination de particules de latex rouge, sensibilisées par un anticorps monoclonal permettant de détecter spécifiquement un antigène de surface de Candida krusei. Les agglutinats sont rouges.
Une réaction positive est visible à l’œil nu sous forme d’agglutinats rouges. Une réaction négative est reconnue par une absence d’agglutination, la suspension reste homogène.
Figure 10. Kit Krusei-Color® : [Photo du service de Parasitologie Mycologie, Hôpital Militaire d’Instruction Mohammed V, Rabat]
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Galerie API 20C AUX® [13,116].
Cette galerie permet d’identifier les levures couramment rencontrées grâce à des tests d’assimilation standardisés et miniaturisés. Cette galerie offre la possibilité d’effectuer 19 tests d’assimilation. Les levures à identifier sont mises dans un milieu synthétique semi-solide à incuber pendant 24à 48h. La croissance se traduit par un trouble. L’identification se fait grâce à des tables analytiques selon le profil numérique de chaque levure.
Figure 11. API 20C AUX® : [Photo du service de Parasitologie Mycologie, Hôpital Militaire d’Instruction Mohammed V, Rabat]
38 III-2-1-6. Interprétation
Seuls les prélèvements tissulaires ou de sites normalement stériles permettent d’affirmer l’infection fongique et son caractère invasif (hémocultures, liquide céphalorachidien, liquide pleural, etc.…)
Pour les autres sites, l’interprétation est plus complexe, notamment pour les voies aériennes :
Pas de valeur diagnostique de l’isolement et la numération de Candida sp. sur tous les types de prélèvements respiratoires, protégés ou non, dirigés ou non.
Seul l’examen histologique permet le diagnostic.
L’isolement de Candida sp à partir d’un prélèvement respiratoire peut être le témoin :
D’une vraie pneumonie au cours d’une candidémie.
D’une simple colonisation trachéo-bronchique.
La figure 12 nous présente l’arbre décisionnel d’une candidose à partir de prélèvements pulmonaires positifs à candida sp [30,88].
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Figure 12 : Arbre décisionnel d’une candidose à partir de prélèvements
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