Thrombasthénie de Glanzmann De la physiopathologie au traitement
III. Diagnostic biologique
Le diagnostic biologique est fait sur :
Un temps de saignement (TS) allongé > 20 min. le temps de saignement est de la
pierre angulaire de l’exploration de l’hémostase primaire, et il est défini comme le temps nécessaire à l’arrêt spontané d’un saignement provoqué par une petite coupure superficielle. Il explore les différents éléments concourant à l’hémostase primaire, soit les plaquettes, la paroi vasculaire et le VWF.
La standardisation des techniques par des procédés à usage unique a amélioré la fiabilité de ce test qui s’effectue classiquement, selon la méthode décrite initialement par Ivy, par une incision cutanée superficielle au niveau de l’avant-bras sous une pression constante de 40 mm Hg. Dans ces conditions, le temps de saignement(TS) se situe entre 4 et 8 minutes.
Avant toute pratique d’un TS, l’interrogatoire doit rechercher la prise de salicylés ou d’anti-inflammatoires non stéroïdiens, qui allongent le TS par l’inhibition pharmacologique des fonctions plaquettaires. Par ailleurs, il est parfaitement inutile de demander un TS devant une thrombopénie, et notamment pour un taux inférieur à 50 109/l. En l’absence de thrombopénie, le temps de saignement est allongé dans les cas de thrombopathies, acquises ou héréditaires, perturbant les fonctions plaquettaires, ou dans la maladie de Willebrand [33, 39,40].
Une agrégation plaquettaire nulle quel que soit l’inducteur physiologique utilisé
(ADP, collagène, thrombine, acide arachidonique, épinéphrine) [33].
Les tests d’agrégation plaquettaire sont de pratique courante en médecine humaine lors de suspicion de thrombopathie congénitale ou acquise [15,17].
- Principe
Les mesures de l’agrégation plaquettaire sont réalisées à l’aide d’un agrégomètre. Ce type d’appareil existe selon deux types :
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- les agrégomètres à impédance (correspond pour le courant alternatif à la résistance pour les courants continus),
- les agrégomètres optiques.
Agrégomètre à impédance
Dans la méthode à impédance, les échantillons sanguins sont dilués en présence d’une solution saline ou tamponnée. L’agrégation plaquettaire est alors détectée par la mesure de l’impédance électrique entre deux électrodes immergées dans l’échantillon. Une gamme étalon doit au préalable être réalisée avec des électrodes recouvertes d’une monocouche de plaquettes. On ajoute alors un agoniste dont le rôle est de permettre l’agrégation. L’accumulation de plaquettes sur les électrodes diminue alors l’impédance entre celles-ci. L’agrégation plaquettaire est par conséquent mesurée par des variations d’ohms. Cette méthode est longue à réaliser, mais sa sensibilité est très forte et permet de mettre en évidence des petites variations d’impédance si toutefois l’agrégation n’est pas masquée par des doses trop importantes d’agonistes [17].
Agrégomètre optique
Cette méthode est fondée sur les variations en lumière de transmission d’un plasma riche en plaquettes (PRP). L’agrégation est alors mesurée par des techniques de turbidimétrie. Une cuvette contenant un nombre défini de plaquettes en suspension dans un PRP est traversée par un rayon de lumière. La majeure partie de la lumière est réfléchie à la source mais une partie parvient à un détecteur de lumière après avoir traversé la solution. Une cuvette contenant un plasma pauvre en plaquettes sert de référence pour une transmission de la lumière de 100 %. La transmission initiale des plaquettes est mesurée (agrégation égale à 0 %) pendant 1 minute afin de supprimer la diminution de la transmission due à la suspension de particules discoïdes en mouvement. Un agoniste est ensuite ajouté dans la cuve ; les plaquettes deviennent alors
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sphériques par changement de conformation. Les plaquettes sphériques arrêtant plus de lumière, il y en a moins qui arrive jusqu’au détecteur. Aussi l’agrégation se traduit comme une diminution de la transmission jusqu’à atteindre un plateau qui permet de calculer le taux et l’importance maximale de l’agrégation [41].
L’absence de thrombopénie et d’anomalie morphologique des plaquettes. Le
diagnostic différentiel doit être fait avec les autres pathologies plaquettaires (maladie de Bernard Soulier, pseudo vonWillebrand...) [33].
La cytométrie en flux, avec utilisation d'anticorps monoclonaux dirigés contre GP
IIb-IIIa, soit directement conjugués, soit révélés par des d'anticorps secondaires marqués avec un fluorochrome, permet d'effectuer le diagnostic. Un grand avantage de cette technique est qu'elle ne nécessite que des quantités minimes de sang d’où son utilité pour le diagnostic chez le nouveau-né.
L'utilisation d'anticorps monoclonaux dirigés contre chacune des deux glycoprotéines, ou encore contre des épitopes dépendants du complexe et enfin dépendants de l'activation, permet la détection de variants correspondant à des anomalies qualitatives des complexes GP IIb-IIIa. L'étude de la fixation du fibrinogène conjugué au FITC est un complément très utile à l'étude de ce récepteur. [31, 42,43].
La recherche du type de Thrombasthénie de Glanzmann (type I < 5 % de GP IIb-IIIa, type II entre 5 et 15 % et variant) nécessite de connaître la quantité de GP IIb-IIIa des plaquettes. L'analyse des chaînes séparées de GP IIb et de GP IIIa est effectuée par électrophorèse en gel de polyacrylamide, en simple ou double dimension, à partir de protéines plaquettaires solubilisées dans le détergent ionique SDS (SDS-PAGE). La recherche de traces de GP IIb ou de GP IIIa est aussi effectuée par immuno-empreintes en utilisant des anticorps monoclonaux ou polyclonaux spécifiques de ces glycoprotéines. La présence ou l'absence de fibrinogène intraplaquettaire est souvent recherchée ainsi que le degré de rétraction du caillot.
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La recherche du défaut génétique des gènes codant pour GP IIb et GP IIIa est réservée aux laboratoires spécialisés dans ces domaines. Les anomalies trouvées à ce jour sont très variées, les mutations se répartissent sur les différents exons codant pour GP IIb ou GP IIIa. Pour les variants, qui sont moins nombreux, une mutation a été trouvée au niveau de l'acide aminé 214 de GP IIIa pour trois différentes familles. Un autre variant présente une mutation au niveau de la partie intracytoplasmique de GP IIIa (acide aminé 752), ce qui entraîne l'incapacité de GP IIb-IIIa à acquérir sa fonction de site récepteur pour le fibrinogène [33, 44,45].
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