Description des constructions plasmidiques utilisées

Pour les immunisations géniques, nous avons utilisé le plasmide pcDNA3.1(+) (Invitrogen) comme vecteur d’expression eucaryote. En effet, celui-ci contient tous les éléments essentiels pour l’immunisation génique (Figure 36) :

-Un site de sous-clonage multiple dans lequel est inséré l’ADNc d’intérêt. -Un promoteur CMV (« human cytomegalovirus immediate-early enhancer »), promoteur viral situé en amont du site d’insertion de l’ADNc d’intérêt et permettant sa forte expression transitoire dans un grand nombre de cellules eucaryotes.

-Un gène codant la β-lactamase conférant aux bactéries transformées une résistance à l’ampicilline. Celui-ci permet la sélection des clones transformés durant l’étape d’amplification bactérienne. D’autre part, sa séquence riche en CpG joue un rôle dans la stimulation de la réponse immunitaire.

-Un signal de polyadénylation (BGH pA) de l’hormone de croissance bovine assurant la terminaison transcriptionnelle appropriée de l’ARNm d’intérêt.

Vecteur d’expression eucaryote Gène de résistance à l’ampicilline Séquence d’origine de réplication Promoteur du cytomégalovirus Site de clonage Signal de polyadénylation de l’hormone de croissance bovine

Figure 36 : Schéma d’un vecteur d’expression eucaryote illustrant ses principales caractéristiques.

III.1.2.1.1 Caractéristiques de la séquence de la protéine prion utilisée et constructions plasmidiques

La protéine prion humaine entière (PrP1-253) a été clonée par PCR (« Polymerase Chain Reaction ») au laboratoire, à partir d’ADN génomique provenant de PMBC (« Peripheral Blood Mononuclear Cells ») (Padiolleau-Lefèvre et al., 2007). Après vérification de la séquence amplifiée, la PrP1-253 a été sous-clonée dans le vecteur pcDNA3.1 (p3-PrP1-253).

Pour favoriser, d’une part, la rencontre entre l’antigène et les lymphocytes B circulants et, d’autre part, la présentation, après endocytose, des peptides antigéniques par le CMHII présent à la surface des CPAs et ainsi stimuler une réponse immunitaire spécifique humorale, notre stratégie est d’utiliser comme immunogène la protéine prion

humaine (PrP1-229) dépourvue de son ancre GPI (Figure 37) ainsi la PrPc sera libérée dans le milieu extracellulaire. Nous avons inséré la séquence codant pour la PrP1-229 dans le vecteur pcDNA3.1 selon le protocole suivant :

Protocole (Figure 37) :

-Clonage de la PrP1-229 à partir du vecteur p3-PrP1-253. Le couple d’amorce

utilisé pour l’amplification PCR présente les séquences suivantes 1) Primer for :

5’-GTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTGCTCGGATCCCG-3’ et 2) Primer PrP229 :

5’-GCCCTCTAGACTCGAGCGGCCGCCACTGTGTCATCATCCTCTCTGGTAATAGGCCTGAGATTCC-3’. Les conditions

suivantes ont été utilisées pour un volume réactionnel de 50µl : 1µl de p3-PrP1-253 à 1,5ng/µl, 5µl de tampon 10X Accutaq, 2,5µl dNTP à 10mM, 0,5µl de chaque amorce à 100pmol/µl et 0,5µl d’Accutaq 5u/µl (Sigma). Deux concentrations en MgCl2 ont été testées : 2,5mM et 4,5mM. Les paramètres du cycle de PCR sont :

Les produits de chaque condition d’amplification PCR sont visualisés sur gel d’agarose 1%. Le produit d’une des conditions (MgCl2 2,5mM, température d’hybridation 68˚C) est purifié sur système Ultra-Free DA (Millipore) puis par extraction phénol/chloroforme et précipité au NaCl 0,4M une nuit à -20˚C.

-Insertion du produit d’amplification PCR dans le vecteur pcDNA3.1. Le produit

PCR purifié ainsi que le vecteur pcDNA3.1 sont digérés par HindIII et XbaI (Biolabs, New England) 5h à 37˚C. Le vecteur pcDNA3.1 linéarisé et ensuite déphosphorylé à ses extrémités 5’ (CIP, ...). Le produit PCR digéré y est inséré en présence de 1µl de T4 ligase 400unités/µl (Biolabs) 1h à 20˚C. Le produit de ligation est précipité au NaCl 0,4M une nuit à -20˚C puis repris dans 10µl d’H2O. Des bactéries DH5α électrocompétentes sont transformées par 2µl du produit de ligation et sont étalées sur milieu sélectif contenant de l’ampicilline (pour laquelle le plasmide pcDNA3.1 posséde le gène de résistance).

-Criblage des plasmides contenant la PrP1-229. Les clones sont cultivés 6h en

milieu liquide LB (Luria Broth, Sigma) sélectif et directement criblés par PCR. Le couple d’amorce utilisé pour l’amplification PCR présente les séquences suivantes 1) Primer

for : 5’-GTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTGCTCGGATCCCG-3’ et 2) Primer PrP229

cribl :5’GCGGGTTTAAACGGGCCCTCTAGACTCGAGCGGCCGCCACTGTGTCATCA-3’. Les conditions suivantes ont été utilisées pour un volume réactionnel de 50µl : 5µl de culture bactérienne, 5µl de tampon 10X Redtaq, 2,5µl dNTP à 10mM, 4µl de MgCl2, 0,5µl de chaque amorce à 100pmol/µl et 2,5µl de RedTaq 1u/µl (Sigma). Les paramètres du cycle de PCR sont :

Les produits PCR sont ensuite visualisés surun gel d’agarose 2%. L’ADN plasmidique des clones positifs est purifié avec le kit MiniPrep (BioRad) puis séquencé.

La séquence du haut représente la séquence entière de la protéine prion humaine (PrP1-253). La séquence du bas représente la séquence de la protéine prion humaine sans son ancre GPI (PrP1-229). La séquence signal permettant la sécrétion de la protéine est représentée en vert. L’ancre GPI permettant l’ancrage de la protéine à la membrane plasmique est représentée en bleu foncé. La séquence hybridante des primers est représentée par une flèche bleu clair et la non hybridante en rose.

Par visualisation des produits PCR sur gel d’agarose, nous avons obtenu de nombreux clones positifs. Les ADN plasmidiques de deux d’entre eux ont été purifiés et envoyés au séquençage (p3-PrP1-229 clone D3 et p3-PrP1-229 clone D5). Aucune mutation nucléotidique, même silencieuse, n’a été mise en évidence (annexe 2). Ces deux constructions vont donc être testées pour leur fonctionnalité ex vivo.

Une des difficultés de ce modèle d’étude est que la protéine d’intérêt est faiblement immunogène car présentant 90% d’homologie de séquence avec une protéine ubiquiste. Pour pallier ce problème, notre équipe a développé, ces dernières années, une stratégie qui consiste à fusionner la séquence d’une protéine faiblement immunogène à celle d’un

épitope T « universel »(Tymciu et al, 2004). La séquence codant cet épitope T fusionnée

avec celle de l’ADNc d’intérêt joue un rôle équivalent à une protéine porteuse (comme la BSA ou la KLH) lors d’une immunisation protéique (Figure 38). Une étude menée par Kumar et al. a montré que le fragment 829-844 de la toxine tétanique (de séquence IQYIKANSKFIGITEL) est capable de stimuler la réponse immunitaire, lors d’une immunisation peptidique, chez plusieurs souches de souris (Kumar et al., 1992). En effet, ce fragment est présenté par le CMHII d’une grande variété d’haplotypes de souris (H-2^s, H-2^d, H-2^b) : il s’agit donc d’un épitope T dit « universel » car capable de stimuler la réponse immunitaire indépendamment de la restriction génique des CPA. De plus, ce fragment n’engendre pas d’effet secondaire et de réponse immunitaire spécifique lorsqu’il est couplé à la protéine d’intérêt.

1 :Antigène (Ag) composé d’épitopes B (rose) et d’épitope T (vert). Reconnaissance de l’Ag par les Ig présents à la surface du LB. 2 :internalisation et fragmentation de l’Ag reconnu. 3-4 : présentation des épitopes T au LT CD4⁺ via le CMHII (ou HLAII). 5 : Activation du LT CD4⁺ entraînant la sécrétion d’interleukines. 6 :Activation paracrine des LB par les interleukines. 7 : Différenciation des LB en plasmocytes et sécrétion d’anticorps circulants spécifiques de l’Ag.

Figure 38 : Coopération lymphocytes T et lymphocytes B.

Nous avons donc inséré la séquence codant la toxine tétanique 829-844 dans le vecteur p3-PrP1-229 par double amplification PCR selon le protocole suivant :

Protocole (Figure 39) :

-Première amplification PCR. Le couple d’amorce utilisé pour l’amplification PCR

présente les séquences suivantes 1) Primer for :

5’-GTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTGCTCGGATCCCG-3’ et 2) Primer TT2 :

5’-GGTGATACCGATGAATTTGGAGTTAGCCTTGATGTACTGGATTCCTCTCTGGTAATAGGCC-3’. Les conditions

suivantes ont été utilisées pour un volume réactionnel de 50µl : 1µl de p3-PrP1-253 à 1,5ng/µl, 5µl de tampon 10X DyNAzyme EXT, 1µl dNTP à 10mM, 0,5µl de chaque amorce à 100pmol/µl et 2,5µl de DyNAzyme EXT 1u/µl (Sigma). Deux concentrations en MgCl2 ont été testées : 2,5mM et 4,5mM. Les paramètres du cycle de PCR sont :

Les produits de chaque condition d’amplification PCR sont visualisés sur gel d’agarose 1%. Le produit d’une des conditions (MgCl2 2,5mM, température d’hybridation 72˚C) est utilisé comme matrice pour la deuxième PCR.

-Deuxième amplification PCR. Le couple d’amorce utilisé pour l’amplification

PCR présente les séquences suivantes 1) Primer for :

5’-GTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTGCTCGGATCCCG-3’ et 2) Primer TT1 :

5’-CGGGCCCTCTAGACTCGAGCGTCACAGTTCGGTGATACCGATGAATTTGG-3’. Les conditions de PCR utilisées

sont les mêmes que pour la première PCR. Les produits de chaque condition d’amplification PCR sont visualisés sur gel d’agarose 1%. Le produit d’une des conditions (MgCl2 2,5mM, température d’hybridation 68˚C) est purifié sur système Ultra-Free DA (Millipore) puis par extraction phénol/chloroforme et précipité au NaCl 0,4M une nuit à -20˚C.

-Insertion du produit d’amplification PCR dans le vecteur pcDNA3.1. Le produit

PCR purifié ainsi que le vecteur pcDNA3.1 sont digérés par HindIII et XbaI (Biolabs, New England) 5h à 37˚C. Le vecteur pcDNA3.1 linéarisé est ensuite déphosphorylé à ses extrémités 5’ (CIP, ...). Le produit PCR digéré y est inséré en présence de 1µl de T4 ligase 400unités/µl (Biolabs) 1h à 20˚C. Le produit de ligation est précipité au NaCl 0,4M une nuit à -20˚C puis repris dans 10µl d’H2O. Des bactéries DH5α électrocompétentes sont transformées par 2µl du produit de ligation et sont étalées sur milieu sélectif contenant de l’ampicilline (pour laquelle le plasmide pcDNA3.1 posséde le gène de résistance).

-Criblage des plasmides contenant la PrP1-229-TT. Les clones sont cultivés 6h en

milieu liquide LB (Luria Broth, Sigma) sélectif et directement criblés par PCR. Le couple d’amorce utilisé pour l’amplification PCR présente les séquences suivantes 1) Primer for : 5’-GTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTGCTCGGATCCCG-3’ et 2) Primer TT1 :

utilisées pour un volume réactionnel de 50µl : 5µl de culture bactérienne, 5µl de tampon 10X Redtaq, 2,5µl dNTP à 10mM, 4µl de MgCl2, 0,5µl de chaque amorce à 100pmol/µl et 2,5µl de RedTaq 1u/µl (Sigma). Les paramètres du cycle de PCR sont les mêmes que ceux utilisés pour le criblage de la construction p3-PrP1-229. Les produits PCR sont ensuite visualisés sur un gel d’agarose 2%. L’ADN plasmidique des clones positifs est purifié avec le kit MiniPrep (BioRad) puis séquencé.

Par visualisation des produits PCR sur gel d’agarose, nous avons obtenu de nombreux clones positifs. L’ADN plasmidique de deux d’entre eux a été purifié et envoyé au séquençage (p3-PrP1-229-TT clone C4 et p3-PrP1-229-TT clone D5). La construction p3-PrP1-229-TT clone C4 présente une délétion d’un acide aminé alors que la construction p3-PrP1-229-TT clone D5 ne présente aucune mutation protéique (annexe 2). Toutefois, deux mutations nucléotidiques silencieuses ont été observées pour la construction p3-PrP1-229-TT clone D5. Ces deux constructions vont être testées pour leur fonctionnalité ex vivo.

III.1.2.1.2 Fonctionnalité des constructions plasmidiques ex vivo

Afin de sélectionner les constructions à utiliser pour l’immunisation génique, nous avons vérifié la fonctionnalité ex vivo des deux constructions p3-PrP1-229 (clone D3 et clone D5) ainsi que celles p3-PrP1-229-TT (clone C4 et clone D5). Pour cela, nous avons testé l’expression de la protéine prion humaine dans le surnageant de culture et le culot cellulaire par un dosage immunométrique et par immuno-transfert trois jours après transfection transitoire de cellules COS par les différentes constructions.

III.1.2.1.2.1 Dosage immunométrique

Pour doser spécifiquement la protéine prion humaine, nous avons utilisé comme anticorps de révélation l’anticorps monoclonal Pri308 couplé à l’AChE. Cet anticorps a été obtenu par immunisation du peptide synthétique 106-126 de la protéine prion humaine chez des souris invalidées pour le gène Prnp.

Protocole (Figure 40 ):

Trois jours après la transfection de cellules COS par les différentes constructions, les surnageants de culture sont prélevés. Après un lavage en PBS, les cellules sont ensuite récupérées et comptées. Elles sont ensuite lysées en tampon Triton-DOC (150mM NaCl, 50mM Tris-HCl, 0,5% Triton X-100, 0,5% sodium deoxycholate, pH 7,5). La concentration en protéine totale du surnageant de culture et des extraits cellulaires est déterminée par un dosage colorimétrique BCA (bicinchoninic acid assay, Pierce). La protéine prion humaine est ensuite dosée par le dosage immunométrique suivant : l’anticorps monoclonal SAF34, produit au laboratoire, à 10µg/ml en tampon phosphate 50mM, est immobilisé sur la phase solide 96-puits (Immunoplate, Maxisorp, Nunc) par incubation une nuit à température ambiante, puis les sites non spécifiques sont saturés en BSA (tampon EIA : 0,1M tampon phosphate pH 7,4 contenant 0.1% de BSA, 0,15M NaCl et 0,01% d’azide de sodium). Les plaques sont conservées à 4°C jusqu’à leur utilisation. 100µl des différents surnageants de culture et culots cellulaires (à 100ng/µl et 50ng/µl) en tampon EIA sont incubés une nuit à 4°C. Après 3 lavages, 100µl/puits de

Pri308 couplé à l’acétylcholinestérase (AChE) à 5 unit/µl en tampon EIA sont incubés pendant 2 heures à température ambiante. Après 6 lavages, l’activité de l’AChE est mesurée par la méthode colorimétrique d’Ellman, comme décrit précédemment (Grassi et al., 1989). La mesure de l’absorbance à 414nm à 15minpermet d’évaluer directement la quantité de PrP humaine présente dans les différents échantillons testés. Les résultats sont donnés en DO/106 cellules.

Comme le montre la Figure 41, aucun signal n’est détecté dans les différentes fractions de cellules COS non transfectées (NT) ou transfectées avec le vecteur vide (pcDNA3.1). On observe un signal dans les deux fractions (surnageant de culture et culot cellulaire) des cellules transfectées par les 4 vecteurs étudiés. Quelle que soit la construction, un signal de forte amplitude est observé dans le surnageant de culture, laissant supposer que les protéines d’intérêt sont bien sécrétées par les cellules COS. Nous pouvons mettre en évidence que les constructions PrP1-229 clone D5 et p3-PrP1-229-TT clone D5 permettent une meilleure expression de la protéine prion humaine. Cependant, l’ajout de l’épitope T semble diminuer la synthèse de la protéine d’intérêt de l’ordre de 50%.

Expression protéique des constructions plasmidiques par des cellules COS

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 NT pc^DN A3^.1 p3^-P rP 1-22⁹ D3 p3^-P rP 1-22⁹ D5 p3^-P rP 1-22 9-TT ^C 4 p3^-P rP 1-22 9-TT ^D 5 D O /1 0^ 6 ce llu le s surnageant de culture culot de cellules

Le signal obtenu pour chaque fraction (surnageant de culture et culot cellulaire) est rapporté à la quantité en protéines totales et au nombre de cellules.

Figure 41 : Détection de l’expression de la protéine prion humaine après transfection transitoire de cellules COS par dosage immunométrique.

III.1.2.1.2.2 Immuno-transfert

Protocole (Figure 42 ):

Trois jours après la transfection de cellules COS par les différentes constructions, les cellules sont récupérées et comptées. Elles sont ensuite lysées en tampon Triton-DOC (150mM NaCl, 50mM Tris-HCl, 0,5% Triton X-100, 0,5% sodium deoxycholate, pH 7,5). La concentration en protéine totale des extraits cellulaires est déterminée par un dosage colorimétrique BCA (bicinchoninic acid assay, Pierce). La protéine prion humaine est ensuite mise en évidence par immuno-transfert selon le protocole suivant : 10µg de protéines totales du culot cellulaire sont séparés selon leur poids moléculaire apparent. Après migration électrophorétique en condition SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis sodium dodecyl sulfate, 2h sous 150V) et transfert sur membrane de nitrocellulose (1h sous 110V), cette-dernière est saturée (30min en PBS-1% tween 20-5% BSA). Après lavage, la membrane est incubée avec l’anticorps SAF60 à 0.1µg/ml pendant 30min à température ambiante puis avec l’anticorps secondaire anti-IgG couplé à la peroxydase pendant 20min à température ambiante. L’activité de la peroxydase est détectée par chimioluminescence (Pierce).

Comme le montre la Figure 43, aucun signal n’est détecté dans les culots de cellules COS non transfectées (NT) ou transfectées avec le vecteur vide (pcDNA3.1). On observe une bande au poids moléculaire attendu pour les 4 constructions soit respectivement 24kD pour les deux constructions PrP1-229 et 26kD pour les deux constructions p3-PrP1-229-TT. Toutefois, on peut remarquer que l’intensité du signal est plus forte pour les constructions p3-PrP1-229 clone D5 et p3-PrP1-229-TT clone D5. Ainsi, en accord avec les résultats obtenus par dosage immunométrique, ces deux constructions semblent les mieux exprimées.

Figure 43 : Détection de la protéine prion humaine par immuno-transfert.

En vue des immunisations géniques, les deux constructions p3-PrP1-229 clone D5 et p3-PrP1-229-TT clone D5 ont été sélectionnées et purifiées en grande quantité en utilisant le kit Giga-Prep endotoxine free (Qiagen).