Nosso modelo experimental para a indução das arritmias já está bem consolidado na literatura (Miletich et al, 1978; Weigth et al, 1998; Kawai et al, 2002; Kagawa, et al 2005). Brevemente, em relação ao modelo de arritmias cardíacas in vivo utilizado nesse estudo, ele é baseado no fato do halotano alterar a velocidade de condução intraventricular do impulso e na potencialização desse efeito pela adrenalina (Takada et al, 1993). A adrenalina sintética injetada é um composto simpatomimético, ou seja, ela é capaz de reproduz os efeitos provocados pela estimulação dos nervos simpáticos. Quando injetada em altas concentrações ela pode provocar aumento do ritmo e débito cardíaco, do consumo de oxigênio e também irritabilidade das células NSA (principalmente quando sua injeção está associada a anestésicos como o halotano). Anestésicos voláteis podem afetar diretamente as correntes iônicas diminuindo a condução do impulso o que pode desencadear alterações no ritmo cardíaco (Weigth et al, 1998). O halotano é tradicionalmente considerado como pró-arrítmico predispondo o coração á arritmias ventriculares (Teixeira-Neto et al, 2000). Possivelmente, ele age como um detergente alterando a fluidez e expansão da membrana plasmática o que pode gerar desestabilização do potencial de membrana dos cardiomiócitos resultando em arritmias (Miletich et al, 1978).
Desde a sua descoberta, a Ang-(1-7) se tornou alvo de diversas pesquisas na área de fisiologia cardiovascular e vários estudos mostram os efeitos cardioprotetores desse peptídeo (Ferreira et al, 2001; Gembardt el at, 2003; Santos et al, 2004; Castro et al, 2006). Nesse trabalho observamos que a Ang-(1-7) apresenta atividade antiarrítmica in
vivo. Esse efeito ocorreu de forma aguda após a injeção desse peptídeo na veia jugular de
ratos nos quais foram induzidos eventos arrítmicos. Além disso, ele foi bifásico, sendo que a concentração que provocou uma significativa redução das arritmias foi a de 4 nM. Esse efeito bifásico da Ang-(1-7) também já foi observado em outros estudos. Por exemplo, foi demonstrado que a Ang-(1-7), em concentrações maiores, é capaz de facilitar as arritmias de reperfusão (Neves et al, 1997) e camundongos transgênicos que superexpressam a ECA2, o que possibilitaria um aumento nos níveis de Ang-(1-7), morrem em decorrência de arritmias cardíacas (Donoghue et al 2003). Esses dados corroboram com os nossos resultados que mostram um efeito arrítmico da Ang-(1-7) em concentrações maiores. É importante ressaltar que a concentração fisiológica de Ang-(1-
7) na circulação sanguínea é de aproximadamente 20 pg/mL (McKinney et al, 2014). Alguns autores sugerem que concentrações suprafisiológicas, na ordem de micromolar, de Ang-(1-7) são capazes de ativar o receptor AT1 (Brosnihan et al, 1996, Bosnyak et al,
2012).
Em concordância com a literatura, o efeito antiarrítmico provocado pela administração da Ang-(1-7) ocorreu via ativação do Mas (Santos et al, 2003), uma vez que a presença do antagonista seletivo desse receptor, o A-779, foi capaz de bloquear o efeito antiarrítmico da Ang-(1-7). Além da ativação do receptor Mas, a ação antiarritmogênica da Ang-(1-7) está relacionada com a liberação de NO. Já foi demonstrado que a Ang-(1-7) via Mas ativa a proteína fosfatidilinositol 3-quinase B o que leva a ativação da proteína quinase B (Akt) com consequente fosforilação da enzima óxido nítrico sintase determinando a geração de NO em cardiomiócitos ventriculares (Dias-Peixoto et al 2008). De fato, cardiomiócitos ventriculares isolados tratados com Ang-(1-7) apresentam produção significativa de NO (Gomes et al, 2010). A injeção de Ang-(1-7) na veia jugular de ratos hipertensos promoveu um aumento na produção de NO no coração (Costa et al, 2010) e cultura de células endoteliais incubadas com a Ang-(1-7) apresentaram produção significativa de NO após 5 min do estímulo sendo que a fosforilação e ativação da Akt ocorreu 1 min após a incubação com a Ang-(1-7) (Sampaio et al, 2007b).
De acordo com esses dados, utilizando o L-NAME, nós demonstramos que o NO está envolvido nos efeitos antiarrítmicos in vivo da Ang-(1-7). Com o bloqueio dessa enzima a quantidade de eventos arrítmicos permaneceu alta o que evidencia que o NO é importante para a redução das arritmias. É importante ressaltar que a manutenção dos níveis basais de NO é crucial, pois a injeção apenas de L-NAME deixou os animais mais propensos ao desenvolvimento de arritmias. De fato, já foi demonstrado que o NO participa de efeitos antiarrítmicos durante eventos de isquemia e reperfusão (Kisvari et al, 2014). Estudos in vivo utilizando corações de cães e porcos mostraram uma diminuição da produção de NO durante a oclusão de artéria coronária. Essa redução na quantidade de NO contribuiu para o desenvolvimento de arritmias ventriculares fatais, indicando que a manutenção da síntese de NO pelas enzimas endógenas ou através da administração de compostos doadores de NO pode gerar uma cardioproteção (Kiss et al, 2010). O efeito cardioprotetor do NO é mediado por uma série de eventos, por exemplo, atenuação do
stress oxidativo no miocárdio via diminuição da produção de superóxido (inibindo as enzimas xantina oxidase e xantina desidrogenase que geram os superóxidos). O NO também atua diretamente na função mitocondrial, uma vez que ele pode interagir com a cadeia transportadora de elétrons e proteínas desacopladoras diminuindo a produção de superóxido por essa organela (Burwell e Brookes, 2008; Kiss et al, 2010). Além disso, o NO pode promover diminuição da severidade das arritmias via ação direta em junções comunicantes (GAP junctions) ou em canais iônicos promovendo aumento intracelular de GMPc e diminuição do transiente de cálcio (Gonczi et al, 2009). O NO também participa do controle da contratilidade do coração e da FC, contribui para o remodelamento cardíaco após infarto e protege contra isquemia, além de modular o sistema nervoso simpático (Rastaldo et al, 2007). Já se sabe que esse gás pode ser produzido por três isoformas de enzimas via conversão de L-arginina em L-citrulina: óxido nítrico sintase endotelial (eNOS), neuronal (nNOS) ou induzida (iNOS), sendo que essas três isoformas são expressas em corações de mamíferos (Rastaldo et al, 2007). A inibição da nNOS e da eNOS, encontradas tipicamente associadas à membrana do RS e das cavéolas do coração, provoca diminuição da contração cardíaca e do transiente de cálcio, o que mostra a existência de uma sinalização via NO que é essencial para a transdução de sinais cardíacos (Jian et al, 2014). Já existem evidências que o NO apresenta efeitos antiarrítmicos em modelos animais e em humanos (Burger & Feng, 2011), porém os mecanismos específicos de sua ação ainda não estão completamente esclarecidos.
A atividade cardioprotetora da Ang-(1-7) também pode ser explicada de forma indireta por meio da potenciação dos efeitos da bradicinina (BK) (Paula et al, 1995; Almeida et al, 2000) ou através do antagonismo dos efeitos deletérios da Ang II (Santos et al, 2000). Considerando a potenciação dos efeitos da BK, já se sabe que existe uma interdependência entre o SRA e o sistema calicreína-cinina (SCC). Esse último sistema está envolvido na regulação da pressão arterial, inflamação, homeostase cardiovascular, respostas analgésicas, proliferação celular e liberação de citocinas (Naffah-Mazzacoratti et al, 2014). Um dos principais produtos do SCC é a BK que no sistema cardiovascular apresenta ação vasodilatadora estimulando a liberação de NO. Estudos já mostraram que a Ang-(1-7) não só atua como substrato para ECA, mas também inibe essa enzima (Paula et al, 1995; Almeida et al, 2000). Por sua vez, a ECA também degrada a BK. Assim, se a ECA for inibida, a degradação da BK diminui potencializando seus efeitos (Su JB, 2013).
Existe então, um cross-talk entre o SRA e o SCC o que pode ajudar a explicar os efeitos benéficos da Ang-(1-7), como por exemplo, através da inibição da ECA e diminuição da degradação da BK no coração.
É importante destacar que a Ang-(1-7) não provocou alterações na PAM e na FC, indicando que os efeitos antiarrítmicos desse peptídeo foram independentes de mudanças em parâmetros hemodinâmicos. O aumento da PAM observada nos grupos adrenalina e adrenalina + Ang-(1-7) pode ser atribuído a injeção da adrenalina sintética que é um composto simpatomimético, ou seja, capaz de reproduz os efeitos provocados pela estimulação dos nervos simpáticos. Considerando os parâmetros hemodinâmicos, a adrenalina quando injetada intravenosamente desencadeia aumento da resistência vascular periférica causando aumento da PAM (Teixeira-Neto et al, 2001).
O DIZE é um composto utilizado para o tratamento da tripanossomíase e leishmaniose animais, pois ele impede a replicação do DNA e a atividade mitocondrial dos patógenos causadores dessas doenças (Hwang et al, 2010; Stewart et al, 2010; Kuriakose & Jude, 2014). Considerando os estudos sobre o SRA, já foi demonstrado que esse composto é capaz de ativar a ECA2 (Kulemina & Ostrov, 2011; Kuriakose & Jude, 2014). O DIZE quando administrado 2 dias antes da indução de isquemia do miocárdio em ratos aumenta a atividade da ECA2 e é capaz de promover a diminuição de áreas de infarto, aumentando o número de células progenitoras cardíacas e modulando a produção de citocinas pró-inflamatórias (Qui et al, 2013). Ele afeta o sistema imune diminuindo a produção de citocinas pró-inflamatórias como as interleucinas 6 e 12 e o fator de necrose tumoral (TNF-α) (Kuriakose & Jude, 2014), o que sugere que o DIZE é um composto que tem efeito anti-inflamatório. Em nosso trabalho foi demonstrado que o DIZE apresenta um evidente efeito antiarrítmico. Contudo, ao contrário do que esperávamos esse efeito foi extremamente agudo, ou seja, assim que o DIZE foi injetado os ratos não apresentavam mais eventos arrítmicos ou, quando tinham, esses eventos eram esporádicos. Assim, acreditamos que não havia tempo suficiente para o DIZE ativar a ECA2 e estimular a produção de Ang-(1-7). Dessa forma, é possível que essa resposta imediata provocada pelo DIZE não esteja totalmente associada à produção de Ang-(1-7), mas ao contrário, esse composto poderia interagir diretamente com fatores ou estruturas celulares ainda não identificadas, modulando o desencadeamento de arritmias. De fato, já foi descrito que a ECA2 atua também como receptor de alguns vírus como o vírus Sars-
CoV causador da Síndrome Respiratória Aguda Grave (Clarke & Turner, 2012). Além disso, estruturalmente a ECA2 pode ser entendida como uma quimera, apresentando homologia na região catalítica com a ECA e na região transmembrana com a colectrina que é uma chaperona molecular (Clarke & Turner, 2012). Essas características mostram que a ECA2 apresenta potencial para desencadear outras funções biológicas adicionais, as quais poderiam ser moduladas pelo DIZE reduzindo as arritmias. É importante considerar que o DIZE apresenta rápida absorção e pode atravessar a membrana plasmática das células via difusão simples (Kuriakose & Uzonna, 2014), o que corrobora ainda mais com o rápido curso temporal em reduzir as arritmias cardíacas. Porém, ainda são necessários outros experimentos para a elucidação de como o DIZE e a ECA2 interagem e se eles realmente interagem em nosso modelo. Apesar disso, os nossos dados permitem concluir que o DIZE pode atuar de forma aguda e sua ação não é bloqueada pelo A-779, o que mostra uma independência da ativação do Mas. Além disso, o NO não participa dos efeitos do DIZE, pois houve uma redução significativa das arritmias mesmo com a administração de L-NAME precedente à administração do DIZE.
Uma vez demonstrado o grande potencial antiarrítmico in vivo da Ang-(1-7) e do DIZE, nós resolvemos investigar como os cardiomiócitos isolados reagiriam em um modelo similar ao utilizado in vivo (agonista adrenérgico associado ao anestésico halotano), focando na contratilidade, excitabilidade e manejo intracelular de cálcio. É importante ressaltar que nos experimentos a nível celular foram necessárias três modificações em relação ao modelo de experimentação in vivo: 1) O uso do isoproterenol como agonista adrenérgico em substituição à adrenalina. Essa alteração foi realizada com o objetivo de estudar de maneira mais específica o efeito da estimulação simpática nos cardiomiócitos isolados, uma vez que a estimulação beta-adrenérgica é responsável pelos efeitos inotrópicos, lusitrópicos e cronotrópicos no coração (Bers, 2001). 2) O uso do halotano solubilizado na concentração de 0,9 mM que, de acordo com a literatura, equivale a inalação de halotano 1,5% (Eskinder et al, 1991). 3) O uso de camundongos como modelo animal de experimentação. Essa alteração foi feita com base na observação de que a preparação de células ventriculares de ratos é muito mais susceptível ao desenvolvimento de alterações celulares mesmo na ausência da administração de qualquer substância, o que comprometia a avaliação dos resultados.
A partir dos experimentos de contratilidade celular, verificamos um efeito agudo da Ang-(1-7) e do DIZE. Isso porque logo após a perfusão desses compostos houve redução do número de eventos arritmogênicos por minuto, por célula. Também houve redução na proporção de células que desencadearam arritmias (presença de contrações espontâneas desencadeadas sem estimulação prévia). Esses dados estão de acordo com os resultados obtidos in vivo.
É importante destacar que, aparentemente, o aumento dos parâmetros contráteis dos cardiomiócitos está relacionado com a administração do isoproterenol, uma vez que ele é um agonista beta-adrenérgico. Com exceção dos efeitos do DIZE na taxa máxima de contração e de relaxamento, o halotano, a Ang-(1-7) e o DIZE não interferiram nos efeitos do isoproterenol. A ativação dessa via nos cardiomiócitos induz a produção de AMPc através da adenilato ciclase. O aumento na concentração de AMPc induz a ativação da proteína quinase A (PKA) que, por sua vez, provoca a fosforilação de diversos componentes envolvidos no acoplamento excitação-contração e desencadeia o aumento nas respostas inotrópicas e lusitrópicas observadas pela estimulação adrenérgica. Especificamente, ocorre a fosforilação dos RyRs aumentando sua probabilidade de abertura (Bers 2001), que em conjunto com a fosforilação do canal para cálcio Cav1.2, induz um aumento na amplitude do transiente de cálcio citoplasmático. Além disso, a PKA fosforila a fosfolambam, removendo a inibição da Ca+2-ATPase do RS (SERCA) e conferindo um efeito lusitrópico positivo. Assim, mesmo com a perfusão da Ang-(1-7) e do DIZE o aumento na fração de encurtamento e o efeito lusitrópico positivo foram mantidos, sugerindo que esses compostos atuam reduzindo a propensão celular à arritmia sem alterar a sinalização beta-adrenérgica induzida pelo isoproterenol. É importante ressaltar que muitos medicamentos antiarrítmicos disponíveis na clínica provocam uma melhora do quadro de arritmia mas, podem causar redução da força de contração, sendo dessa forma contra indicados para pacientes que também apresentem insuficiência cardíaca.
Considerando a derivada da taxa máxima (dL/dt) de contração e de relaxamento, foi observado um aumento em relação ao controle em todos os grupos que foram perfundidos com o isoproterenol. Mais uma vez, isso mostra que esse evento está relacionado à cinética de ligação e desligamento do cálcio aos miofilamentos, a qual é drasticamente alterada pela ativação da via adrenérgica pelo isoproterenol. Entretanto, é
importante notar que o DIZE ainda promoveu um aumento adicional nesses parâmetros, fato que ainda não sabemos explicar.
Analisando a excitabilidade dos cardiomiócitos através dos experimentos de patch
clamp demonstramos que após a administração de Ang-(1-7) ou DIZE houve
hiperpolarização do potencial de repouso e redução da fase de repolarização do PA. Considerando a hiperpolarização do potencial de repouso, é importante mencionar que esse evento pode representar um efeito antiarritmogênico. Isso porque quanto menor o potencial de repouso, mais difícil será para atingir o limiar de excitação e desencadear um evento de despolarização arrítmico. Já o encurtamento do PA (provocado pela redução da fase de repolarização) pode ser cardioprotetor. No nosso caso, um PA mais curto diminui a chance de ocorrência de eventos de pós-despolarização. São conhecidos dois tipos de pós-despolarização: precoce (PDP) e tardia (PDT) (Berne & Levy, 2009). Geralmente, as PDP e PDT aparecem no final do platô do PA ou durante a fase de repolarização e tendem a ocorrer com maior probabilidade em células cardíacas com PA prolongado. Por isso, uma diminuição da fase de repolarização do PA pode contribuir para o não aparecimento desses eventos que são pró-arrítmicos.
É importante considerar que tanto a PDP como a PDT estão relacionadas com o íon Ca+2. Por exemplo, quando o PA está prolongado, os canais para Ca+2 que foram ativados no início do platô têm tempo suficiente de se restabelecerem da inativação e, assim, podem ser reativados antes que a célula seja totalmente repolarizada. Essa ativação secundária desses canais poderia deflagrar uma PDP, promovendo a entrada de cálcio adicional que irá ativar os RyRs liberando mais cálcio para o citoplasma e desencadeado uma contração prematura. Já a PDT está associada com uma elevada concentração intracelular de Ca+2. Uma maior concentração de cálcio no citoplasma pode, por exemplo, ativar o trocador Na+/Ca+2. Esse trocador é eletrogênico e gera uma corrente despolarizante na célula quando funcionando em seu modo normal, uma vez que transfere 3 íons Na+ para dentro da célula para cada íon Ca+2 que ejeta. Isso acaba criando uma corrente de Na+ que contribui para o aparecimento da PDT. Outros mecanismos associados com a redução do cálcio citoplasmático são: a SERCA, a Ca+2-ATPase sarcolemal (PMCA) e o uniporte mitocondrial de Ca+2 (Bers 2001).
Ao analisarmos o PA dos cardiomiócitos a 50% da fase de repolarização, observamos que a associação do halotano com isoproterenol provocou um aumento significativo desse parâmetro. Esses dados estão em concordância com achados prévios que mostraram uma redução de diversos tipos de correntes de potássio induzida pelo halotano (Eskinder et al, 1991) em associação com o aumento na corrente de cálcio induzido pelo isoproterenol (Bers 2001), o que em conjunto aumenta a duração da fase de platô. Entretanto, ao analisarmos o tempo para 50% da repolarização na presença da Ang- (1-7) e do DIZE foram obtidos valores semelhantes aos do controle. Esse fenômeno sugere uma modulação dos canais para potássio e/ou cálcio por essas moléculas de modo a normalizar a densidade de corrente dos cardiomiócitos conferindo cardioproteção. É importante nesse ponto ressaltar o papel da Ang-(1-7) na produção de NO, uma vez que essa molécula, via ativação de produção de GMPc através da guanilato ciclase, pode induzir a fosforilação do Cav1.2 (Massion et al 2003), importante canal relacionado com a entrada de cálcio na célula que quando fosforilado pode reduzir o influxo desse íon. Interessantemente, esses compostos isolados (halotano e isoproterenol) não foram capazes de provocar alterações significativas no tempo para repolarização do PA a 50% quando comparado ao controle. Com esses experimentos podemos sugerir que a Ang-(1- 7) e o DIZE preveniram o influxo excessivo de Ca+2 via canal de cálcio do tipo L (LTCC) cuja atividade estava aumentada pela estimulação adrenérgica, regulando, assim, a ativação dos RyRs e liberação de cálcio (utilizado para a contração) pelo RS.
Foi observado também um prolongamento do PA a 10% da repolarização de forma semelhante à 50%. Isso pode ser explicado pelos mesmos motivos citados acima. Além disso, o isoproterenol pode não apenas ter provocado aumento na atividade dos LTCC, mas também pode ter mudado a sua dependência de voltagem para ativação e inativação (Bers, 2001). Dessa forma, a ativação deslocada para potenciais mais negativos pelo isoproterenol em conjunto com o bloqueio das correntes de potássio pelo halotano, podem justificar o aumento na duração dessa fase do PA. Em relação ao encurtamento provocado pelo DIZE e Ang-(1-7), os mesmos mecanismos discutidos para 50% da repolarização podem ser aplicados.
Ainda em relação à excitabilidade das células cardíacas, não observamos nenhuma alteração significativa na amplitude do PA (exceto no grupo isoproterenol). Apesar disso, observamos, em todos os grupos administrados com halotano, uma redução na taxa
máxima de despolarização do PA (dV/dt), o que sugere um bloqueio pelo halotano dos canais para sódio Nav1.5, como já descrito na literatura (Weigth et al, 1998). Além disso, nem o DIZE nem a Ang-(1-7) foram capazes de reverter esse fenômeno. Isso sugere que esses compostos não interferem nas correntes de sódio bloqueadas pelo halotano, ou seja, esse não é um mecanismo de ação do DIZE ou da Ang-(1-7), uma vez que eles não foram capazes de reverter esse bloqueio. Entretanto, esses dados não nos permite excluir a possibilidade do DIZE e da Ang-(1-7) impedirem a atuação do halotano na célula por outros mecanismos.
Com os experimentos de microscopia confocal observamos a participação fundamental do cálcio intracelular nos nossos resultados. Considerando as waves (ondas de cálcio no citoplasma desencadeadas por uma reativação em cadeia dos RyR que acontece de maneira assincrônica e iniciada pelo cálcio), foi observada uma redução significativa com a incubação de Ang-(1-7) e DIZE. Se analisarmos o transiente, podemos observar que o isoproterenol, pela ativação da via beta-adrenérgica, induziu um aumento na amplitude da onda de cálcio (F/F0). Isso está relacionado com a alteração provocada por esse composto na liberação do cálcio (via fosforilação dos RyR, aumentando sua probabilidade de abertura) e também com o aumento desse íon no RS (relacionado com o aumento na taxa de recaptação via SERCA). Além disso, o halotano vem sendo caracterizado por interagir com membranas, o que pode implicar na desestabilização das estruturas associadas a elas. Assim a partir dos nossos resultados, podemos inferir que os mecanismos envolvidos na geração das arritmias em nosso modelo foram a ativação beta-adrenérgica associada à presença do halotano gerando um aumento na probabilidade de abertura dos RyR e propiciando um vazamento muito grande de cálcio do RS, o que desencadeia a geração de sparks de cálcio durante o período diastólico favorecendo o aparecimento das waves de cálcio. Esse fenômeno é altamente favorecido pelo aumento da corrente de cálcio via LTCC induzido pelo isoproterenol, o que associado à alta taxa de recaptação de cálcio para o retículo pela