MAPN: First-in-Class Reagent for Kinetically Resolved Thiol-to-Thiol Conjugation
Chapitre 2 Développement de méthodes instrumentales en IM-MS native
Chapitre 2 : Développement de méthodes instrumentales en IM-MS
native.
Chapitre 3 : Etude d’un complexe enzyme/substrat par MS native :
le système PRMT6/SAH/peptide H4.
Chapitre 4 : Criblage de complexes enzyme/ligand par MS native :
le système Tgt/inhibiteurs.
Chapitre 5 : Criblage de complexes enzyme/ligand par IM-MS
native: le système PDF1B/inhibiteurs.
Chapitre 6 : Etude d’un complexe enzyme/cofacteur/ligand par
IM-MS native : le système QR2.
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Introduction : état de l’art et objectifs.
Plus de 80% des agents thérapeutiques approuvés par l’agence américaine du médicament (FDA) au cours des 10 dernières années reposent sur l’utilisation de petites molécules ou ligands, interagissant spécifiquement et réversiblement avec une cible thérapeutique (protéine, acide nucléique) afin d’en moduler l’activité (enzymes) ou la fonction (récepteurs, transporteurs) [1, 2]. L’identification de telles espèces dans le secteur pharmaceutique revêt un intérêt majeur, impliquant le recours à des techniques de criblage robustes et orthogonales telles que la résonance plasmonique de surface (SPR), la dénaturation thermique (TSA) ou encore la thermophorèse à micro-échelle (MST), capables de sonder l’existence d’interactions entre la cible biologique et de larges banques de composés chimiques de taille et hétérogénéité variables [3, 4]. L’identification d’une série restreinte de ligands ou « hits » à l’issue de cette première étape nécessite la validation des interactions, ce qui passe par une caractérisation structurale approfondie des complexes non-covalents formés en présence de ces espèces. Cette seconde étape, plus stringente, s’achève par la proposition de candidats ou « leads » dont les propriétés physicochimiques seront optimisées à des fins cliniques [5, 6].
1. Le criblage de complexe protéine-ligand par MS native.
L’apport de la spectrométrie de masse native s’est particulièrement illustré au sein de ces différentes étapes. Couplé à un système d’infusion nanoESI automatisable dès 2003 [7, 8], cet outil s’est révélé compatible à l’analyse haut-débit, permettant le criblage de centaines de composés par jour à partir de faibles quantités de matériel [9, 10]. Le maintien des complexes non-covalents lors de leur transfert en phase gazeuse permet une détection directe de la masse et intensité des espèces à l’équilibre en solution, pouvant donner accès à des informations structurales détaillées [11, 12]:
Ø L’analyse qualitative des spectres ainsi obtenus permet de déterminer la stœchiométrie et sélectivité d’interaction de ligands pour différentes cibles d’intérêt (Fig.1a), incluant des acides désoxyribonucléiques [13-15], ribonucléiques [16-18] ou encore des protéines [19-21].
Ø Le développement de méthodes de quantification adaptées, s’appuyant sur des expériences de titrage et/ou de compétition, permet de déterminer la spécificité de ces interactions et
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d’en mesurer l’affinité relative ou absolue (Kd) sur une gamme de concentration, s’étendant de 10-9 à 10-3 M (Fig.1b) [22-25].
! L’analyse de la stabilité de ces complexes en phase gazeuse peut également fournir une information structurale considérable. L’énergie nécessaire à la dissociation par collision de
50% des espèces (Vc50) s’avère proportionnelle à la contribution des interactions de type
polaire (Fig.1c) [26-28].
La caractérisation de métalloprotéines [29-31], d’enzymes [32, 33], de récepteurs ou de pompes protéiques [34, 35] par MS native a ainsi révélé les propriétés de fixation de métaux, cofacteurs, ligands endogènes [36], lipides, glucides [37] sur leurs complexes associés, permettant une meilleure compréhension structurale de ces assemblages. Fournissant des données comparables à celles obtenues en solution par des approches complémentaires, la MS native s’est avérée prometteuse pour la caractérisation de ligands hydrophobes. Bien que défavorisés en phase gazeuse, certaines optimisations instrumentales et expérimentales permettent néanmoins de préserver ces interactions apolaires, nécessaires à leur caractérisation [38-40].
Figure 1 : Représentation schématique des informations structurales accessibles par MS native. La détermination de la masse et de l’intensité des complexes formés en présence de mélanges protéine-ligand permet une détermination de la nature et stœchiométrie d’interaction des partenaires (a), ainsi qu’une quantification relative ou absolue de leur affinité (b). Une évaluation de la stabilité de ces espèces en phase gazeuse peut également être fournie à travers leur dissociation (c).
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2. Le criblage de complexes protéine-ligand par IM-MS native.
En dépit des informations structurales apportées, le criblage de complexes protéine-ligand par MS native présente une sensibilité restreinte pour la conformation des espèces. Cette principale limitation restreint le champ d’application de cette technologie, le mode de fixation de certains ligands passant par la reconnaissance d’un conformère protéique particulier et/ou l’induction de changements conformationnels spécifiques [41-43]. Face à cet écueil, la mobilité ionique et sa capacité de séparation conformationnelle des ions en phase gazeuse constitue une alternative prometteuse dans l’analyse de complexes non-covalents [44-46]. Couplée à la MS native depuis 2006, cette approche s’est révélée compatible avec la préservation de la structure tridimensionnelle native des espèces ionisées, soulignant l’intérêt de l’IM-MS native dans le criblage conformationnel de complexes protéine-ligand [47-49].
Malgré ce potentiel, l’application de cette stratégie s’est à ce jour révélée sporadique, réservée à la compréhension des mécanismes d’agrégation amyloïde et au développement d’inhibiteurs spécifiques [50-55], ainsi qu’à l’étude de protéines intrinsèquement désordonnées [56-58]. Des études de criblage conformationnel préliminaires à ces travaux de thèse, réalisées au laboratoire par les Drs. Cédric Atmanene et Stéphanie Petiot-Bécard, avaient permis de révéler de subtils changements de conformation induits par la fixation de ligands (sucres, inhibiteurs) sur certaines protéines cibles thérapeutiques (répresseur transcriptionnel bactérien, protéine anti-apoptotique humaine) [59, 60]. Les différences de CCS (ΔCCS) alors rapportées au cours de ces études et dans la littérature [61] avaient permis de situer les limites de résolution conformationnelle accessibles sur les cellules de mobilité ionique TWIMS dans une gamme de ΔCCSs de 2 à 5 %.
Dans le même temps, des études parallèles menées par les équipes du Pr. Brandon Ruotolo et du Pr. Neil Oldham suggéraient le recours à un criblage basé sur la stabilité conformationnelle des complexes protéine-ligand en phase gazeuse [62, 63]. L’évaluation de ce critère à travers le criblage d’inhibiteurs de la protéine kinase Abl révélait ainsi l’existence de 2 catégories de ligands, confondus sous une conformation globale identique bien que se fixant sur 2 sites différents de l’enzyme [45, 64]. L’identification de 2 profils d’activation conformationnelle induits en présence de ces ligands s’est ici avérée prometteuse, permettant de contourner les limites de résolution instrumentale et d’enrichir le panel d’informations accessibles par criblage IM-MS.
100 3. Objectifs des travaux.
Les objectifs de ce travail de thèse consistent à développer des approches de criblage conformationnel de systèmes protéine-ligand. Par analogie aux informations structurales accessibles par MS native, ces optimisations devront ainsi permettre d’étendre les critères de criblage à la sélectivité, l’impact et la stabilité conformationnelle associés au recrutement de ligands sur leur cible (Fig.2).
Figure 2 : Représentation schématique des informations conformationnelles accessibles par IM-MS native. La détermination de la section efficace (CCS) des complexes formés en présence de mélanges protéine-ligand doit permettre d’évaluer la sélectivité conformationnelle du ligand pour sa cible (a), ainsi que son impact conformationnel (b).
La mise en place du criblage IM-MS native passe par une optimisation préalable des méthodes instrumentales dans chacune des dimensions. Les développements réalisés en MS native et en IM-MS ainsi que leur application au criblage de systèmes protéine-ligand sont exposés dans les chapitres suivants.
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