Développement de méthodes

Développement de méthodes

Les détecteurs à fluorescence sont utilisés en chromatographie en phase liquide lorsque des limites de détection et une sélectivité excellentes sont nécessaires. Le développement complet de méthodes, notamment de méthodes d’acquisition de spectres, est fondamental pour obtenir de bons résultats. Ce chapitre décrit trois opérations distinctes pouvant être réalisées avec le dét-ecteur à fluorescence Agilent. Tableau 9, page 78 présente une vue d'ensemble des avantages des différentes modes de fonctionnement pendant ces opéra-tions.

Tableau 9 Etapes impliquées dans le développement complet de méthodes

Etape 1 : Vérification du système

Etape 2 : Optimisation des limites de détection et de la sélectivité

Etape 3 : Paramétrage des méthodes de routine

Balayage fluorimétrique Recherche des impuretés (par exemple, dans les solvants et les réactifs)

Détermination simultanée des spectres d’excitation et d’émission d’un composé pur

Mode signal Commutation de longueur

d’onde

Pour obtenir les limites de détection les plus basses Mode spectral/détection à

longueur d’onde multiple

Détermination des spectres Ex/Em de tous les composés séparés en une analyse unique

Utilisation simultanée de jusqu’à quatre longueurs d’onde

Collecte des spectres en ligne, recherche en bibliothèque et

détermination de la pureté des pics

Désactivation de la commutation de longueur d’onde

Manuel d’utilisation du FLD Agilent 1260 79 Utilisation du détecteur à fluorescence

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Opération 1 : Recherche d'impuretés dans le système CPL

Pour la détection de fluorescence à l'état de traces, il est indispensable que le système CPL soit dépourvu de contamination fluorescente. La plupart des contaminants proviennent de solvants impurs. Un balayage fluorimétrique permet de vérifier la qualité d’un solvant en quelques minutes. Pour ce faire, vous pouvez, par exemple, remplir directement la cuvette du FLD avec le sol-vant pour effectuer une mesure hors ligne, même asol-vant une analyse chromato-graphique. Le résultat peut être affiché sous forme d’un tracé

d’isofluorescence tridimensionnel. Les différentes couleurs traduisent les dif-férentes intensités.

Figure 29, page 79 montre un échantillon d’eau légèrement impure destiné à être utilisé comme phase mobile. La zone où apparaît la fluorescence de l’échantillon d’eau contaminé se situe entre les raies de lumière parasite : la lumière parasite de Raleigh dans le 1er et 2ème ordre et la lumière parasite de Raman.

Les longueurs d’onde d’"excitation" et d’"émission" étant les mêmes pour la lumière parasite Raleigh, la raie de lumière parasite Raleigh dans le premier ordre apparaît en haut à gauche du graphique. Les raies Raman de l’eau se trouvent au-dessous de la lumière parasite Raleigh dans le premier ordre.

Comme le filtre passe-bande élimine les longueurs d’onde inférieures à 280 nm, la lumière parasite Raleigh dans le second ordre apparaît au-dessus de 560 nm.

Un échantillon d'eau pure a été introduit dans la cuve à circulation. Les spectres ont été acquis par pas de 5 nm.

Figure 29 Tracé d’isofluorescence d’une phase mobile

>bejgZi‚ &ZgdgYgZ GVbVc 'ƒbZdgYgZ

80 Manuel d’utilisation du FLD Agilent 1260

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La lumière parasite a le même effet que les impuretés, à savoir qu’elle simule un bruit de fond. Dans les deux cas, le niveau de bruit est plus élevé, les limi-tes de détection sont de ce fait plus élevées. Cela signifie que des mesures très sensibles sont à effectuer à des longueurs d’onde éloignées des points de consigne qui présentent un fond de lumière parasité élevé.

Manuel d’utilisation du FLD Agilent 1260 81 Utilisation du détecteur à fluorescence

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Opération 2 : Optimisation des limites de détection et de la sélectivité

Pour obtenir les limites de détection et la sélectivité optimales, les analystes doivent déterminer les propriétés fluorescentes des composés d’intérêt. Pour obtenir des limites de détection et une sélectivité optimales, les longueurs d’onde d’excitation et d’émission peuvent être sélectionnées. En général, les spectres de fluorescence obtenus avec des instruments différents présentent des différences considérables liées au matériel et aux logiciels utilisés.

L’approche classique consiste à extraire une longueur d’onde d’excitation appropriée à partir du spectre UV, qui est similaire au spectre d’excitation de fluorescence (voir Figure 30, page 81), puis à enregistrer le spectre d’émission.

Ensuite, lorsque la longueur d'onde d’émission optimale est déterminée, le spectre d’excitation est acquis.

Vous devez répéter cette opération pour chaque composé à l’aide d’un spectro-photomètre à fluorescence ou sur un système CPL sans circulation. Chaque composé doit normalement être analysé séparément. Ainsi, un ensemble de spectres d’excitation et d’émission est obtenu (Figure 29, page 79) pour cha-Spectre d'excitation

avec une émission à 440 nm, spectre d'émission avec une excitation à 250 nm pour la quinidine à 1 µg/ml.

Paramètres de détection :

Pas de 5 nm, PMT de 12, temps de réponse de 4 s.

Figure 30 Spectres d’excitation et d’émission de la quinidine Adc\jZjgY»dcYZPcbR

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que composé. Cette procédure étant fastidieuse, elle n’est appliquée que lors-que le nombre de composés d’intérêt est limité.

Le système CPL Agilent Infinity série 1200 offre trois moyens différents d’obtenir des informations complètes sur la fluorescence d’un composé : Procédure I - Effectuer un balayage fluorimétrique hors ligne pour un compo-sé unique comme indiqué ci-dessus pour la phase mobile. Pour cela, on utilise de préférence une cuvette à FLD manuelle lorsque des composés purs sont dis-ponibles.

Procédure II - Effectuer deux analyses par CPL avec le détecteur à fluores-cence Agilent Infinity 1260 pour séparer le mélange de composés dans des conditions connues et acquérir séparément les spectres d’émission et d’excita-tion.

Procédure III - Utiliser un couplage FLD /DAD Agilent Infinity série 1200 et acquérir les spectres UV-Visible (équivalents aux spectres d’excitation) avec le DAD et des spectres d’émission avec le FLD, le tout en une seule analyse.