Détermination de la pureté du solide

En accord avec (ICH, International Conference on Harmonisation, Guideline Q3A (R2) 2006), les impuretés sont définies comme tous les composants de la nouvelle substance médicamenteuse qui ne sont pas une entité chimique définie comme la substance médicamenteuse. La nature et la quantité des ces impuretés est régies par un certain nombre de facteurs, y compris la route de synthèse pour la substance, les conditions de réaction, la qualité des matières premières, les réactifs, les solvants, les étapes de purification, le processus et le stockage (Basak et al. 2007). Ces impuretés sont classées comme organiques, inorganiques ou des solvants résiduels.

Les impuretés organiques (liées au procédé ou à la molécule) peuvent apparaître durant le processus de fabrication et/ou de stockage du produit. Ils peuvent être identifiés ou non identifiés, volatiles ou non (exemple, les produits de dégradation). Les impuretés inorganiques peuvent provenir du processus de fabrication. Ils sont normalement connus et identifiés (exemple : les sels inorganiques, tels que les tampons phosphate). Les solvants sont des liquides inorganiques ou organiques utilisés en tant que véhicules pour la préparation de solutions ou de suspensions dans la synthèse d'une nouvelle substance médicamenteuse. Dans la plupart de cas, ces impuretés doivent être éliminées ou au moins minimisées, car leurs présences en grande quantité peuvent influencer l'efficacité et la sécurité du produit fini (Basak et al. 2007; Hulse et al. 2008). Ainsi, l'identification, la quantification et le contrôle de ces impuretés sont importants pendant le processus de développement d'un nouveau produit.

Quantification des impuretés organiques 2.6.1

Afin de déterminer la pureté organique des cristaux de LASSBio-294 formés à travers le processus de cristallisation par effet anti-solvant, 0,5 g de la poudre est dissoute avec 60% d’acétonitrile et 40% de solution tampon phosphate pour avoir une concentration de 10 µg/g de solution. Ces solutions sont mises sous ultrasons pendant 15 minutes pour assurer que 100 % de la molécule soit dissoute. Ensuite, ces échantillons sont analysés par HPLC selon la méthode décrite dans la partie 2.3.2.1. La pureté organique est calculée à partir du rapport entre la concentration mesurée pour la poudre synthétisée et la poudre initiale (Équation 33). Les résultats de cette caractérisation seront présentés dans le Chapitre 4.

Pureté= ^{AireÉchantillon}

Aire_LASSBio !294 xPureté LASSBio!294(%) Équation 33

Aire_Échantillon: aire d’échantillon contenant la poudre synthétisée (100 % dissous) (mAU*s) ;

Quantification du solvant résiduel 2.6.2

Dans le cas des impuretés de solvants résiduels, les limites acceptables dans les produits pharmaceutiques pour la plupart des solvants sont présentés par (ICH International Conference on Harmonisation, Guideline Topic Q3C (R4) 2009)(ICH, International Conference on Harmonisation, Guideline Q3A (R2) 2006). Cette directive recommande l'utilisation de solvants moins toxiques et décrite les niveaux considérés comme acceptables sur le plan toxicologique pour certains solvants résiduels. Pour des solvants où l'utilisation doit être éviter (Classe 1), comme le benzène la concentration limite est de 2 ppm. Pour des solvants d'utilisation limité (Classe 2), comme l'acétonitrile et le méthanol, les concentrations limites sont respectivement de 410 ppm et 3000 ppm. Enfin, pour des solvants de faible potentiel toxique (Classe 3), comme l'acétone une concentration limite de 5000 ppm est acceptable.

En ce qui concerne l'utilisation de LIs comme solvants, aucune directive décrivant les limites acceptables pour ce type de solvant n'a été publiée. Considérant leur faible toxicité, nous pouvons envisager de limiter la concentration résiduelle des LIs à 5000 ppm.

Des méthodes qui reportent la détermination des LIs commençant à recevoir très attention (Molíková et al. 2009 ; Gao et al. 2010 ; Huang et al. 2012). La détermination des anions du LI est principalement effectuée par chromatographie ionique (Villagrán et al. 2004 ; Hao et al. 2008). D'autre part, la quantification des cations peut être réalisée par chromatographie liquide de phase reverse (Stepnowski & Mrozik 2005), par chromatographie ionique (Gao et al. 2010) et par électrophorèses capillaire (Qin et al. 2002; Markuszewski et al. 2004).

Dans ce travail, nous développerons une méthode de quantification du cation 1-éthyl-3-méthylimidazolium [emim] du LI par chromatographie ionique. Cette technique est un type de chromatographie liquide : la phase stationnaire est un solide et la phase mobile est un liquide. Comme tout système de chromatographie, une chromatographie ionique comprend : un système d’injection ; une pompe de circulation ; une colonne de séparation spécifique aux éléments à analyser ; un éluant qui assure le transport des espèces et un système de détection (Figure 2.11).

Figure 2.11. Schéma du système de chromatographie ionique.

La colonne de séparation est constituée par une résine échangeuse d'ions. Le mécanisme qui régit ce processus est l’interaction électrostatique entre les ions présents dans l’échantillon et ceux présents dans les résines d’échanges constituées de groupements ionisés. Les groupements dérivés d’acide sulfonique et d’acide carboxylique sont utilisés pour l’échange de cations, pendant que les sels d’ammonium quaternaire et les amines pour l’échange des anions (Figure 2.12). L’échantillon à analyser est injecté en tête de colonne. La migration des espèces se fait selon leur affinité pour la résine. La migration est assurée par l’éluant, (acide pour le dosage de cations, basique pour le dosage des anions) injecté par la pompe.

Figure 2.12. Représentation schématique du processus de séparation par

chromatographie ionique. Les ions d’échantillons sont présentés par A (analyte) et les ions de l'éluant par E.

En sortie de colonne chaque élément ainsi séparé est caractérisé par le détecteur. Le détecteur classique est une cellule de conductivité. L’amplitude du signal dépend de la

Colonne

Injection _{Suppresseur Détecteur}

Pompe Eluant SO₃!" SO₃!" E ⁺ A ⁺ E ⁺ A ⁺ E ^- A ^- E ^- A ^- N R#" ₃ N R#" ₃ Résine d’échange de cations Résine d’échange d’anions

Un système avec un surpresseur est utilisé pour augmenter la sensibilité de la méthode. Son rôle est de supprimer la conductivité de l’éluant, afin que le pic de l’élément à analyser soit le plus net possible. Dans le cas de cations, l’éluant acide est neutralisé par des ions OH -qui suppriment son signal de conductivité. Pour l’analyse des anions, son éluant basique est neutralisé par des ions H⁺ qui suppriment son signal de conductivité. Celui-là est placé entre la colonne et le détecteur.

Le système utilisé dans ce travail pour la quantification du cation (emim) est constitué d’un Chromatographe Ionique Dionex ICS-3000 (Modèle série 1100) équipé d’un détecteur de conductimétrie et un suppresseur LERS 500 (Ultra 4 mm). La séparation est effectuée en utilisant une colonne IonPac CS17 (4 mm x 250 mm) et une pré-colonne IonPac CG17 (4 mm x 50 mm). Les échantillons sont analysés avec un débit de 1,0 mL.min^-1 et volume d'injection de 25 µL à 35 °C. L'éluant est constitué d’un mélange de 80 % d'une solution d'acide méthane-sulfonique (MSA) à 20 mM et 20 % d'acétonitrile. Pour la mise au point de la méthode la linéarité et la spécificité sont déterminées.

Pour la linéarité, sept solutions étalons sont préparées par dilution du LI ([emim][CH₃O(H)PO₂]) dans 100 % ACN : 0,6, 1,4, 6, 14, 29, 57 et 144 µg/g de solution. La droite de régression est calculée en traçant l’aire du pic par la concentration de la solution.

La courbe d’étalonnage obtenue (Aire (µS*min) = 0,0165 C (µg/g solution) - 0,0495) montre une bonne corrélation pour la gamme de concentration étudiée avec un coefficient de corrélation R² = 0,99543, supérieur au minimum recommandé par les agences de régulation (ICH- International Conference on Harmonisation 1996) (FDA 1997).

L'analyse des solutions en absence du LI a démontrée que la méthode est spécifique pour la quantification de ce type de solvant (Figure 2.13).

Ces résultats indiquent que cette méthode est adaptée pour l'analyse de résidu du LI dans le solide (résultats présentés dans le Chapitre 4).

(a) (b)

Figure 2.13. Chromatogramme d'une solution contenant le [emim][CH3O(H)PO2] à 14

µg/g de solution (a) et chromatogramme d'une solution en absence du [emim][CH3O(H)PO₂] et contentant le LASSBio-294 à 4000 µg/g de solution (b).

2.7 Détermination de la viscosité des solutions LI/LASSBio-294 et des mélanges