Lors de différentes études, plusieurs BIMs dérivés de la souche DGCC7710 ont été isolés suite à des mises en contact avec le phage virulent 2972 qui ont permis l’acquisition d’un nouvel espaceur, provenant du génome du phage 2972, à l’extrémité 5’ du locus CRISPR1 (Magadán et al., 2012). Les espaceurs S90 à S95 ont été sélectionnés, car ils ciblent des proto-espaceurs situés 1) dans différentes régions du génome du phage 2972, 2) dans des gènes aux profils d’expression différents et 3) dans gènes avec ou sans fonction connue (voir figure 2.2).
Par la suite, des dilutions sériées d’un lysat du phage 2972 sauvage ont été mises en contact avec les différents BIMs (S90 à S95), ce qui a permis la sélection des phages mutants présents dans la population phagique initiale.
Figure 2.1. Représentation schématique des constructions plasmidiques utilisées pour l’édition du génome du phage
virulent 2972. Les sites de restriction XhoI et EcoRI ont été utilisés pour des clonages directionnels. Les régions homologues au phage 2972 sont représentées par les boîtes blanches. La longueur des gabarits comprenant les régions homologues est indiquée entre parenthèses. Les flèches orange représentent le gène de résistance au chloramphénicol et le gène de résistance à l’ampicilline est représenté par une flèche mauve. (a) Construction des plasmides utilisés pour l’édition de l’orf39 du phage 2972. Les mutations sont indiquées avec l’alignement des séquences des gabarits avec le proto-espaceur S91 et le PAM ainsi que par une ligne rouge dans les boîtes blanches. (b) Construction des plasmides utilisés pour l’édition de l’orf33 du phage 2972. Les gabarits ont été obtenus par amplification PCR en utilisant l’ADN génomique du phage CEMS90 comme gabarit d’ADN. (c) Construction des plasmides utilisés pour l’édition du génome du phage 2972 en remplaçant l’orf33 par la méthylase bactérienne LlaDCHIA (Moineau et al., 1995b). Le vecteur pSMART-LlaDCHIAed a été construit par IDT. Le codon de départ (ATG) est le même pour l’orf33 et LlaDCHIA et le reste de l’orf33 a été soustrait sauf pour l’extrémité 3’ qui contient le site de liaison aux ribosomes (RBS) essentiel pour la transcription de l’orf34. (d) Construction des plasmides utilisés pour l’interférence synthétique. Les losanges noirs représentent les répétitions du locus CRISPR1 de DGCC7710 et les rectangles rouges représentent l’espaceur S91 du BIM S91. La transcription de l’ARNpré-cr synthétique est achevée par le promoteur Pmob.
Figure 2.2. Organisation du génome du phage 2972. Les flèches représentent les cadres de lecture ouverts (orfs)
déterminés par bio-informatique. Les couleurs démontrent le profil transcriptionnel : vert indique l’expression précoce (0 à 7 minutes post-infection), bleu indique l’expression médiane (7 à 22 minutes), rouge indique une expression tardive (12 à 27 minutes) et jaune indique une expression tardive (12 à 27 minutes) avec un patron différent (Duplessis et al., 2005). Les flèches au contour gras et numérotées en rouge représentent les 16 orfs n’ayant aucune fonction connue. L’échelle est en kpb. La position relative des proto-espaceurs ciblés dans de cette étude est indiquée par les numéros «PS».
2.2.2 Criblage des CEMs par séquençage d’amplicons PCR
Ces phages mutants, ou CEMs, peuvent contourner le système CRISPR1-Cas grâce à des mutations, le plus souvent ponctuelles, dans le proto-espaceur ciblé ou le PAM (Deveau et al., 2008). Quatre-vingt-quatorze plages de lyse isolées obtenues sur chacun des cinq BIMs ont été prélevées à l’aide d’une micropipette et d’embouts 100 µl tronqués et stériles. Les plages de lyse ont ensuite été déposées dans des plaques de 96 puits (Starsted) contenant chacun 250 µl de tampon phage 1X. Les phages ont diffusé dans le tampon pendant un minimum de 30 minutes à la température de la pièce et les plaques ont été conservées à 4 °C pour d’autres analyses. Cinq microlitres de chaque solution de phages ont été transférés dans une plaque de 96 pour PCR (BioRad) afin de servir de gabarit d’ADN. Par la suite, 45 µl de solution maîtresse composée de 1 µM de chaque amorce (Invitrogen) (voir tableau 2.2), 0,2 mM de désoxyribonucléoitdes-triphosphate (dNTP, Feldan), tampon PCR simple concentration (Feldan) et 2,5 U de Taq DNA polymerase (Feldan). L’amplification PCR a été effectuée dans un thermocycleur CFX96 C1000 Touch (BioRad). La dénaturation initiale de l’ADN double brin a été effectué à 95 °C pendant 5 minutes suivi de 35 cycles d’une dénaturation pendant 45 secondes à 95 °C, d’une hybridation des amorces pendant 45 secondes (voir tableau 2.2 pour la Tm de chaque paire d’amorces) et d’une élongation par polymérisation pendant 1 minute à 72 °C et le tout suivi d’une élongation finale pendant 5 minutes. Les produits PCR ont été vérifiés par électrophorèse sur gel d’agarose 2 % à 115 V pendant 25 minutes. Les produits correctement amplifiés ont été séquencés à l’aide du séquenceur ABI 3730xl DNA analyzer (Applied Biosystems) disponible à la Plateforme de Séquençage et de Génotypage des Génomes au Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l’Université Laval (CRCHUL). Les séquences obtenues ont été transformées en utilisant PreGap4 et Gap4 (Staden, 1996) et le logiciel BioEdit (Hall, 1999) a été utilisé pour aligner et analyser les séquences en comparaison avec la séquence de référence du phage 2972.
2.2.3 Purification des CEMs d’intérêt
L’analyse des séquences des proto-espaceurs PS90 à PS93, cibles des BIMs S90 àS93, présents dans des gènes codant pour de petites protéines non structurales de fonction inconnue du phage 2972 (voir tableau 1.2) a permis d’identifier certaines positions pouvant mener à des mutations non sens (codon d’arrêt) suite à une mutation ponctuelle. Suite à l’analyse des séquences obtenues lors du criblage (voir section 2.2.2) certains CEMs ayant des mutations d’intérêt ont été identifiés (CEMS90, S91, S92, S93-1 et S93-2).
Les CEMs d’intérêt ont été purifiés trois fois à partir des solutions de phages obtenues à la section 2.2.2. Pour ce faire, des dilutions sériées ont été effectuées à partir de la solution de phages et ont été mises en contact avec le BIM sur lequel les CEMs ont d’abord été isolés. De nouvelles plages de lyse ont été transférées dans du tampon phage 1X pour l’extraction des phages contenus dans la gélose molle. Ces étapes ont été répétées deux autres fois (Moineau et al., 1994). La présence des mutations d’intérêt dans les CEMs purifiés a été confirmée par séquençage des amplicons PCR (voir section 2.2.2).