Champ magnétique (Gauss)
1- Détermination des conditions limites d’utilisation de la microcuve
Pour tester et déterminer les conditions limites d’utilisation du stopped-flow configuré avec la microcuve µFC8, différents types de tests ont été effectués en utilisant une réaction cinétique monophasique impliquant le Nacétyl tryptophane amide (NATA) et le N Brommosuccinimide
La titrage par fluorescence de ces molécules montre que 1 mol de NBS réagit avec 1 mol de NATA ((Peterman 1979)). Lorsque le NATA dans un tampon phosphate à pH7 à 23°C, avec une force ionique de 0.01M, est mélangé par stopped-flow avec une excès molaire (de l’ordre de 10 fois) dans le même tampon, l’intensité de fluorescence du NATA diminue exponentiellement jusqu’à un niveau zéro d’intensité. La vitesse d’extinction de fluorescence augmente de façon proportionnelle à la concentration de NBS et les cinétiques observées sont strictement de premier ordre.
Cette réaction a été, dans un premier temps, utilisée pour tester les conditions d’utilisation du stopped-flow. Le flux limite appliqué à chaque seringue, la viscosité relative limite des solutions à mélanger, ou encore le volume minimum nécessaire sont autant de paramètres qu’il faut déterminer pour connaître avec précision les conditions pour lesquelles la qualité du mélange est adéquate et reproductible. Une grande reproductibilité des cinétiques mesurées dépend de la qualité de l’arrêt du flux (et donc du début de la mesure de la cinétique) et de la qualité de la stabilité du signal (blocage du flux sans fuite). L’efficacité du mélange est estimée en suivant l’intensité de fluorescence lorsque le liquide s’écoule dans la cellule d’observation avant le stop. Dans notre expérience, le temps de flux avant le stop (“flux continu”) est de 10ms (dans la figure 26). Dans le panneau A, le temps zéro se réfère au temps pour lequel le flux de liquide est arrêté : la période de flux qui précède le stop apparaît donc comme un temps négatif). La figure 26 montre que durant ce temps, l’émission de fluorescence augmente et atteint un plateau après 5 ms, indiquant que le mélange est complet. Dans des condition stringentes d’utilisation, des mesures stables et reproductibles sont possibles pour un flux maximum de 17mL/sec, et pour un volume minimum de 180µL pour des mélanges de solutions sans variation de viscosité. Pour les mélanges de solutions de viscosité différentes, le flux maximum est de 15mL/s pour un volume min de 200µL.
Plus le flux est élevé, plus le temps mort est court. Cependant, les flux de 17 et 15 mL/s sont les limites au delà desquelles le système de blocage de l’arrêt du flux (Hard stop) ne résiste pas à la surpression induite. Cela produit un phénomène de fuite, après quelques dizaines de millisecondes, qui provoque une forte déviation du signal.
2-Détermination du temps mort du nouveau mélangeur conçu avec des volumes réduits.
Le temps mort a été estimé à 400 µs en utilisant la réaction d’extinction de fluorescence du NATA par le NBS, à la fois en mode CD et en mode fluorescence. Les traces cinétiques à
partir du temps zéro sont bien ajustées par une équation mono exponentielle, et extrapolées jusqu’à la valeur initiale de fluorescence de 400 µs avant le temps zéro.
Le temps mort est déterminé à partir du tracé de ln(ΔFTot / ΔFObs) versus k ((Hiromi 1979)) où
ΔFTot, le changement total de fluorescence, est calculé pour chaque courbe comme la différence entre l’intensité de fluorescence du NATA et l’intensité de fluorescence à la fin des cinétiques ; ΔFObs est l’amplitude de fluorescence de chaque courbe mesurée à partir du temps 0. Le tracé est linéaire et sa pente donne directement un temps mort de 406± 6 µs pour le mélangeur. Les conditions de tirs, testées à 13 mL/sec, sont compatibles avec les conditions nécessaires pour effectuer des mélanges de solution de viscosité variable (i.e lors de la dilution d’une protéine dépliée dans l’urée).
Bien que le mixer n’offre pas une très grande amélioration en mode fluorescence dans ces conditions, cela permet une amélioration de 10 fois en mode CD puisque les cinétiques de CD peuvent être mesurées avec les mêmes paramètres et la même chambre de mélange, et donc le même temps mort.
Figure 5 : Tests du stopped-flow submilliseconde.
(A) Réaction bimoléculaire test. La cinétique de la réaction entre le NATA, à une concentration finale de 5µM, et de NBS à différentes concentrations : 0 mM (courbe 1), 3 mM (courbe 2), 6 mM (courbe 3) et 10mM (courbe 4). Conditions : NATA et NBS sont mélangés dans un rapport 1 : 1, dans 10 mM de tampon phosphate pH7, 20°C. L’excitation était à 295 nm et un filtre à 325 nm a été utilisé pour l’émission. Les courbes 2 et 3 sont ajustés à une équation monoexponentielle.
(B)Tracé de ln (ΔFtot/ΔFobs) versus k. ΔFtot représente la différence au temps 0 entre la courbe 1 et la courbe 4 dans la figure 1A. La pente de ce graphique décrit un temps mort de 400µs.
k (s -1 ) 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 ln ( ! Ftot /! Fob s) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Temps (s) -0.010 -0.005 0.000 0.005 0.010 0.015 In te n s ité d e F lu o re s c e n c e (u n ité a rb itr a ire ) 2.0 4.0 6.0 8.0 A B (1) (2) (3) (4)
Figure 5 :
A- Appareil de stopped-flow SFM 400 BioLogic. 4 seringues dirigées par
des moteurs pas à pas permettent d’effectuer des mélanges complexes. La poussée de chaque seringue est contrôlée indépendamment par les moteurs pas à pas (6400 pas par tour, permettant une sensibilité de 30 à 200 nanolitres par pas effectué, selon la seringue utilisée).
B – Vue éclatée de la tête d’observation. a) porte cuvette, b) cuvette d’observation en quartz, une partie importante dans les appareils de stopped-flow. Les meilleurs temps morts sont obtenus avec la cuvette
µFC8 (voir texte) ; mais son faible trajet optique réduit le signal de dichroïsme circulaire observé. Volume = 1à 3 µl selon le point d’observation. Trajet optique : 0.8mm.
C – Tête optique : interface entre le stopped-flow et le spectromètre. Composée de 4 ports optiques pour différentes connections : a) illumination, b) et c) à 90° pour les mesures de la lumière de fluorescence, d’anisotropie de fluorescence ou de diffusion, d) à 180° de la source de lumière pour l’absorbance et les mesures de dichroïsme circulaire. (BioLogic, Claix, France).
Figure 5 : Appareil spectrométrique MOS 450 et stopped-flow SFM 400 de BioLogic.
Le spectromètre permet d’illuminer la cuve en sélectionnant les longueurs d’onde dans le spectre UV/visible et le mode de polarisation de la lumière. (BioLogic, Claix, France).
3 -Mise au point des mesures cinétiques par dichroïsme circulaire et tests.
L’appareil de stopped-flow doit être calibré avant toute mesure de CD. Le trajet optique, à travers la micro-cuve comprend 0.8mm de trajet optique dans la solution étudiée et 4 mm dans le quartz de la cuve. Lorsque la cuve est placée dans la tête d’observation, elle subit des pressions verticales suffisantes pour entraîner une modification du signal de dichroïsme circulaire (signal de dichroïsme linéaire). Pour corriger cet effet, une lame de quartz est placée sur le trajet optique en amont de la micro cuve et une molette permet d’y exercer une pression horizontale contrecarrant la pression verticale subie par la cuve en induisant un signal de dichroïsme linéaire perpendiculaire. Le signal CD du glucuronolactone est utilisé pour s’assurer de l’efficacité de la correction. Pour une concentration de 2 mg par mL de glucuronolactone, un signal de CD de 100 millidegrés est attendu et vérifie le bon réglage du stopped-flow submilliseconde en mode CD.
La mesure simultanée de spectre de fluorescence avec ceux de CD a été testée en suivant la réaction de repliement du Lysozyme. Le repliement du lysozyme présente des cinétiques biphasiques typiques qu’il est possible de suivre en fluorescence et par CD dans le même temps.