La détermination de l'amide vinylogue avec les composés dicétones

Il était connu de la littérature que les substances comportant une unité 1,3-dicétone formaient une base de Schiff avec une lysine au site actif de l'enzyme, qui se stabilisait ensuite par tautomérisation en une amide vinylogue [27] [30] [28] [29]_{. Cette amide vinylogue}

possédait une absorption caractéristique dans le spectre UV/VIS dépendante de sa configuration (voir figure 50) [31][32] [33]_, [34]_.

O O NH₂ NH2 NH2 O trans-s-trans λ = 285-305 nm ε = 25'000-35'000 cm-1 M-1 cis-s-cis/cis-s-trans λ = 300-320 nm ε = 10'000-20'000 cm-1 M-1 Figure 50 : Diverses configurations de l'amide vinylogue

Afin de déterminer si la succinylacétone (19) se comportait de la même manière au site actif de la PBGS, un suivi de la réaction par UV/VIS fut entrepris dans nos laboratoires. Un test préliminaire fut effectué en incubant la succinylacétone (19) avec l'acide 6-aminocaproïque (58) ; cet acide nous permettait de simuler la formation d'une base de Schiff entre la succinylacétone (19) et une lysine de l'enzyme.

COOH H₂N

58

La formation de l'amide vinylogue fut suivie, par mesure UV/VIS, tout d'abord pendant 20 h pour connaître la longueur d'onde correspondant au maximum d'absorption. Les spectres furent mesurés toutes les 30 min (voir figure 50). Le maximun d'absorbance était détecté à 314 nm.

Figure 50 : Suivi de la formation de l'amide vinylogue entre la succinylacétone (19, 50 µM) et l'acide 6- aminocaproïque (58, 100 mM)

Ensuite, la formation de cette amide vinylogue fut suivie pendant 64 h en utilisant une concentration fixe de succinylacétone (51.22 µM, 19) et en variant la concentration de l'acide 6-aminocaproïque (50 µM à 1000 µM, 58). La figure 51 montre la courbe de saturation. A partir de cette courbe, nous pûmes calculer l'absorbance à l'infinie ainsi que la constante de formation de l'amide vinylogue (A_inf = 0.956 et K_S = 88 µM) en utilisant l'équation suivante (voir chapitre 5.5) :

y = KS + x + 50 ± (KS + x + 50) 2

- 200 ⋅ x 100

A_∞

où K_s = constante de dissociation du complexe succinylacétone-acide 6-aminocaproïque x = concentration de l'acide 6-aminocaproïque (en µM)

Figure 51 : Courbe de saturation. La concentration de la succinylacétone (19) était de 51.22 µM et neuf concentrations différentes d'acide 6-aminocaproïque (58) furent utilisées (50.09 µM, 101.71 µM, 201.25 µM, 302.09 µM, 401.63 µM, 502.25 µM, 602.66 µM, 803.04 µM et 1002.77 µM)

Le coefficient d'extinction calculé pour le complexe formé entre la succinylacétone (19, 51.22 µM) et l'acide 6-aminocaproïque (58) était de 18'665 M-1 _cm-1_{. La longueur d'onde}

ainsi que le coefficient d'extinction obtenu sont caractéristiques pour une forme cis-s-trans ou cis-s-cis de l'amide vinylogue.

Notre intention était d'appliquer les mêmes conditions en utilisant cette fois-ci l'enzyme à la place de l'acide 6-aminocaproïque (58). Malheureusement, la saturation complète de l'enzyme ne put être obtenue, car pour des concentrations élevées en succinylacétone (19) (supérieures à 15 µM), l'absorbance de la succinylacétone (19) dans la zone de mesure (250 nm à 350 nm) recouvrait l'absorbance de l'amide vinylogue en formation. Pour cette raison, les valeurs obtenues ne permettaient pas de déterminer l'allure de la courbe pour des concentrations supérieures à 15 µM de succinylacétone (19) (voir figure 53). L'absorbance était mesurée à une longueur d'onde de 320 nm (voir figure 52).

-0.1 -0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 200 250 300 350 400 0 min 3h30 6h 22h Absorbance

longueur d'onde (en nm)

Figure 52 : Courbes de la formation de l'amide vinylogue au site actif de la PBGS; la concentration de la succinylacétone (19) était de 12 µM et la concentration de la PBGS était de 14.1 µM (monomères)

Les valeurs d'absorbance suivantes furent déterminées lors du suivi de la formation de l'amide vinylogue au site actif de la PBGS (concentration des monomères = 14.1 µM) :

Figure 53 : Valeurs d'absorbance et courbe de saturation pour la formation de l'amide vinylogue avec l'enzyme ([monomère] =14.1 µM) Succinylacétone (en M) Absorbance observée 2.0 0.059 4.0 0.071 6.0 0.099 7.8 0.116 10.24 0.148 12.19 0.150

La courbe de saturation, passant par les points obtenus expérimentalement, dérivait de l'équation suivante (voir chapitre 5.5) :

y =

K_S + x + [enz] − (K_S + x + [enz])2 - 4 ⋅ [enz] ⋅ x 2 ⋅ [enz]

A_∞

où K_s = constante de dissociation du complexe succinylacétone-enzyme x = concentration de la succinylacétone (en µM)

y = absorbance du complexe succinylacétone-enzyme

La concentration enzymatique utilisée lors des tests était de 14.1 µM (on considérait la concentration des monomères).

Lorsqu'on remplaçait, dans l'équation ci-dessus, la [enz] par 14.1 µM, les paramètres ne convergeaient pas. On ne pouvait justifier ce résultat que d'une seule manière : l'enzyme n'utilisait pas ces huit sites catalytiques lors de la réaction avec la succinylacétone (19). Les mêmes résultats furent obtenus lorsqu'on utilisait une concentration enzymatique de 12.3 µM (concentration correspondant à 7 sites actifs) et de 10.6 µM (concentration correspondant à 6 sites actifs). Par contre, une convergence était observée pour des concentrations de 8.81 µM, 7.05 µM, 5.29 µM, 3.52 µM et 1.76 µM (concentrations correspondant à 5, 4, 3, 2 et 1 site(s) actif(s)). Les régressions non linéraires suivantes furent obtenues pour les concentrations où une convergence était observeée (programme utilisé S-plus) :

Figure 54 : Régressions non linéaires obtenues pour les concentrations où une convergence était observeée Le tableau 14 résume les valeurs de l'absorbance calculées à l'infini (A_inf), les valeurs de la constante de dissociation du complexe enzyme-succinylacétone (K_S) et les coefficients d'extinction correspondants. Les valeurs de l'erreur standard sur les deux constantes A_inf et K_S sont aussi indiquées.

Enzyme (en M) A_inf Erreur K_S (en M) Erreur 1.7625 0.2652 0.0507 8.3669 3.2255 3.5250 0.2498 0.0528 6.4827 3.1606 5.2875 0.2337 0.0576 4.6841 3.1891 7.0500 0.2186 0.0714 3.1030 3.5377 8.8125 0.2162 0.1259 2.2640 5.6261

Enzyme (en M) Coefficent d'extinction (en cm -1 _M-1₎ 1.7625 150'568 3.5250 73'864 5.2875 49'936 7.0500 31'064 8.8125 24'518

Tableau 14 : Résumé des valeurs obtenues

En considérant les résultats obtenus et surtout les erreurs standard calculées pour les deux constantes Ainf et KS, il ne nous était pas possible d'établir, de manière définitive, le nombre de sites utilisés par la PBGS durant sa réaction avec la succinylacétone (19). Il était par contre, tout à fait clair, que l'enzyme n'utilisait ni 8, ni 7, ni 6 de ses sites, puisque les paramètres ne convergeaient absolument pas pour les concentrations correspondantes. Par contre, en tenant compte des travaux antérieurs effectués dans d'autres groupes de recherche, une concentration enzymatique de 7.05 µM, correspondant à l'utilisation de quatre sites actifs sur les huit présents, nous semblait être justifiable et donc, un phénomène de half-site reactivity n'était pas à exclure. La conformation de l'amide vinylogue formée au site actif de l'enzyme ne put être déterminée sans ambiguïté. En effet, la longueur d'onde de 320 nm, correspondant au maximum d'absorbance, indiquerait une conformation du type cis-s-cis ou cis-s-trans, par contre selon le coefficient d'extinction calculé, on serait en présence d'une conformation du type trans-s-trans. Il est clair que les courbes obtenus ne discriminaient ni l'une ni l'autre des conformations. Par contre, vu que les coefficients d'extinction pour une occupation majoritaire des sites actif se situaient proches de la valeur attendue, il était plus que probable que la conformation observée aurait été de la forme cis-s- cis ou cis-s-trans, si les courbes étaient plus précises.