Les composés diacides HOOC COOH

O F HOOC COOH O HOOC NH COOH O HOOC COOH O O O 69 Irréversible 70 Comp. 11'280 µM 71 Irréversible 26 Irréversible HOOC COOH O 25 Irréversible Figure 60 : Diacides C10

Les diacides C10 étaient des analogues de l'intermédiaire postulé dans le mécanisme Jordan I. L'acide 4,7-dioxosébacique (26) était un inhibiteur irréversible présentant quatre points de reconnaissance avec l'enzyme : les deux fonctions cétones et les deux fonctions carboxylates. Une fois au site actif, cet inhibiteur désactivait presque totalement l'enzyme. Il ne restait que 2 % de l'activité originale après 72 h de dialyse. L'introduction d'une fonction amide (composé 71) au site A permettait tout de même de conserver une inhibition irréversible, mais après une dialyse de 72 h, 66 % de l'activité était récupéré. Une idée de l'importance de la gêne introduite par la fonction amide au site A était obtenue en comparant le composé 71 à l'acide 4-oxosébacique (25) où la fonction cétone avait été supprimée. L'acide 4- oxosébacique (25) inhibait encore d'environ 80 % l'activité de l'enzyme après une dialyse de 72 h. Sous les mêmes conditions, en présence du composé 71, l'activité de la PBGS était encore de 66 %. Le remplacement de la fonction cétone par une fonction amide au site A n'était pas aussi contraignant que la suppression totale de cette fonction cétone. La présence de l'amide désactivait partiellement l'électrophilie du carbone et rendait celui-ci moins favorable pour une attaque nucléophile. Le remplacement de la fonction cétone par un

groupe méthyle était désastreux. Le composé 70 présentait une inhibition compétitive avec une constante K_I = 11'280 µM. Le composé 69 montrait trois points d'ancrage de l'inhibiteur au site actif de l'enzyme, mais la présence du groupe fluoro stabilisait l'imine une fois formée, ce qui permettait d'obtenir un inhibiteur irréversible extrêmement efficace.

La série de diacides testés, soit présentés ici soit discutés dans la thèse de Caroline Engeloch-Jarret [90] s'identifiaient avec l'intermédiaire-clef postulé dans le mécanisme Jordan I. Afin de discriminer entre les divers mécanismes proposés, il était important de tester des inhibiteurs qui imitaient l'intermédiaire-clef postulé dans le mécanisme Jordan II/Shemin. Les diacides présentés dans la figure 61 possédaient une fonction acétyle en β d'un des acides carboxyliques et furent synthétisés dans l'optique décrite ci-dessus.

COOH O COOH O COOH O HOOC O HOOC HOOC HOOC HOOC 66 Incomp. 3'200 µM 56 Incomp. 1'350 µM 67 Incomp. 82 µM 68 Comp. 5'600 µM

HOOC COOH

NH-Lys Reconnaissance pour un

inhibiteur compétitif Base de Schiff au site A

Longueur de la chaine trop courte pour atteindre la zone de reconnaissance du carboxylate au site P NH-Lys HOOC HOOC Reconnaissance pour un inhibiteur incompétitif Base de Schiff au site P

Fausse connection par rapport au produit final

Mauvais intermédiaire

Longueur de la chaine trop courte pour atteindre la zone de reconnaissance du carboxylate

au site A

Figure 62 : Reconnaissance des diacides ramifiés au site actif de l'enzyme

Les inhibiteurs 56, 66, 67 et 68 interagissaient au site actif de l'enzyme soit de manière compétitive soit de manière incompétitive et cette interaction pouvait être schématisée comme dans la figure 62 pour le composé 66. Pour analyser les types de comportement obtenus ainsi que les K_I observés, il fallait tenir compte de deux aspects :

• si l'inhibiteur interagissait au site A de l'enzyme (dans ce cas de figure, l'inhibiteur était un analogue du substrat), la longueur de la chaîne séparant les deux fonctions carboxylates étaient importantes afin de permettre aux deux fonctions carboxylates d'atteindre leurs sites de reconnaissance respectifs

• si l'inhibition avait lieu dans le site P de l'enzyme, la connexion de la partie acétyle était erronée par rapport au produit final désiré et de plus, comme dans le cas d'un inhibiteur compétitif, la longueur de la chaîne séparant les deux fonctions carboxylates étaient importantes afin de permettre aux deux fonctions carboxylates d'atteindre leurs sites de reconnaissance respectifs

Les composés 56, 66 et 68 possédaient des KI d'un ordre de grandeur comparable et les différences d'un facteur 2 à 4 dans les valeurs rencontrées pouvaient probablement

s'expliquer par une modification du réseau de ponts d'hydrogène entourant l'inhibiteur au site actif de l'enzyme. Les variations du type d'inhibition étaient probablement concomitantes à la longueur de la chaîne entre les deux fonctions carboxylates et l'inhibiteur s'installait soit au site A soit au site P de manière à minimiser les problèmes stériques dus à une chaîne trop longue et de manière à rechercher les meilleures interactions pour les fonctions carboxylates dans leurs sites de reconnaissance respectifs lorsque la chaîne était trop courte. Le composé 67 est un inhibiteur très intéressant; en effet, il présentait une très bonne constante d'inhibition (K_I = 82 µM). On pouvait envisager que ce composé 67 était tout d'abord reconnu au site P de l'enzyme, ce qui pouvait justifier son comportement incompétitif (voir figure 63). Dans ce cas de figure, le carboxylate au niveau du site A ne présentait pas une reconnaissance idéale, car la chaîne était trop longue. Il pouvait s'ensuivre une transamination par attaque de la seconde lysine (celle présente au site A) et peut-être une rotation au niveau du carbone C(3). Le composé se trouvait lié au niveau du site A et dans ce cas de figure, les deux groupes carboxylates étaient parfaitement reconnus dans leur site respectif. Il pouvait s'installer une sorte d'équilibre entre les deux cas de figure. Il est important de signaler que ce composé 67 est un diacide à 7 carbones, comme dans le cas de l'intermédiaire Jordan II, et que dans le deuxième de cas de figure, le système diacide est parfaitement aligné sur le site actif de l'enzyme.

COOH HOOC

NH-Lys Lys-NH₂

Chaîne trop longue Mauvaise reconnaissance du carboxylate au site A NH-Lys HOOC COOH H2N-Lys Bonne reconnaissance des deux carboxylates

4.8.9 Les dérivés ramifiés