Les caractéristiques communes aux PBGS cristallisées de Saccharomyces cerevisiae, de Pseudomonas aeruginosa et d'Escherichia col

La structure tertiaire de la PBSG est dominée par une unité (α,β)₈ ou aussi appelée TIM barrel (tonneau TIM). La première protéine qui a été déterminée, ayant cette structure, était la triose phosphate isomérase (TIM) [57]. La partie centrale de cette unité est constituée de huit brins β parallèles disposés les uns contre les autres comme les douves d’un tonneau. Les hélices α qui relient les brins β parallèles sont toutes localisées à l’extérieur du tonneau (voir figure 8).

Figure 8 : Représentation de la triose phosphate isomérase; les hélices sont en bleu et les feuillets β en rouge (entrée PDB 1tph) (programme de dessin : Insight II)

L’intérieur d’un tonneau est exclusivement formé par des chaînes latérales provenant de residus de brins β fortement comprimés qui donnent un cœur hydrophobe à l’ensemble de l’unité. La structure entière apparaît compacte et relativement peu flexible. Dans cette structure en TIM barrel, les sites de liaison du ligand sont formés par des régions de loops (boucles) de jonction, situées à l'extrémité carboxy-terminale. Ces régions ne contribuent pas à la stabilité de la structure, mais participent à la fixation du substrat ou à l’activité catalytique [58].

Remarque : si aucune indication n'est donnée, la numérotation correspond à l'enzyme issue de la levure, sinon tout autre source est citée.

Par rapport à l'enzyme TIM, la PBGS montre une hélice α supplémentaire, nommée α8 et formé par les résidus 289-302, située entre deux membres réguliers du TIM barrel (α9 et β9) ainsi qu’un bras caractéristique à l’extrémité amino-terminale. Ces deux régions sont importantes pour les interactions quaternaires.

La PBGS présente une organisation octamérique (voir figure 9) avec un groupe de symétrie I422 ou D₄. Les huit sous-unités sont normalement toutes identiques, excepté pour la PBGS de P. aeruginosa où une dissymétrie des monomères à l'intérieur du dimére fut observée [56]. Les sites actifs sont dirigés vers l’extérieur, vers le solvant, ce qui est en contraste avec des hypothèses antérieures qui supposaient que le site actif se situait à

contacts entre monomères lors de la formation d’un dimère [60]. Le bras de l’extrémité amino-terminale s’enroule autour de la sous-unité voisine, pour former un dimère de la forme 69, où 6 et 9 se situent dans des plans orthogonaux (voir figure 10).

Figure 9 : Représentation de la structure octamérique de la PBGS

Figure 10 : Représentation en forme de ruban du dimère de la PBGS. Les bras à l'extrémité amino-terminale s'enroule autour du monomère voisin

Les loops formant la cavité du site actif contiennent deux lysines adjacentes 210 et 263. La lysine 263 fut aussi déterminée via des méthodes biochimiques, au contraire de la Lys210. En effet dès les années 1960, il était supposé que la première molécule d'ALA (1) formait une base de Schiff avec un acide aminé présent au site actif de l'enzyme. Afin de déterminer la présence de la base de Schiff dans le processus enzymatique, Shemin incuba le substrat naturel, marqué au 14C sur le carbone C(4), avec la PBGS et effectua ensuite une réduction à l'aide du NaBH4 [35]. Cette manipulation inactivait l'enzyme et permettait d'introduire un substrat marqué au sein de l'enzyme. La protéine était ensuite isolée et l'activité enzymatique ainsi que la radioactivité était déterminée. L'inactivation de la PBGS n'était effective qu'en présence du substrat et la PBGS devenait radioactive lorsque le substrat se trouvait au site actif de l'enzyme. Shemin en conclua que le substrat formait une base de Schiff avec un groupe amino du site actif et que l'inactivation et l'incorporation de la radioactivité résultaient de la formation d'une amine secondaire après réduction de cette base de Schiff avec le NaBH4. L'acide aminé responsable de la formation de la base de Schiff pouvait être une lysine. La confirmation de ce postulat fut apportée par Nandi en 1978 [61]. Il incuba la PBGS issue de R. spheroides avec de l'[4-14C]-ALA, effectua la réduction avec du NaBH4 et hydrolysa la protéine. Il effectua une chromatographie bidimensionnelle qui montrait une tache majoritairement radioactive. Après oxydation du produit radioactif, obtenu après l'hydrolyse, avec du periodate de sodium (NaIO4), le produit résultant était l'acide succinique confirmant la présence de l'ALA (1) dans le produit marqué. La nature de l'acide aminé liant l'ALA (1) fut déterminée par comparaison avec le produit synthétique, l'acide N-ε-[4-(5-aminovalérique)]-lysine. Le produit synthétique ainsi que le produit obtenu par dialyse furent confrontés sur couche mince et les deux produits montraient bien un facteur d'élution identique. Nandi put donc conclure que c'était bien le groupe ε-amino d'une lysine qui formait la base de Schiff au site actif.

En utilisant une PBGS, présentant des résidus cystéines modifiée avec l'agent alkylant MMTS (méthylméthanethiosulfonate), donc une PBGS exempte de ions métalliques, Jaffe et al effectuèrent diverses études de la base de Schiff en utilisant la RMN 13C et 15N [62] [63]

Les résultats obtenus furent les suivants :

• la base de Schiff était de manière prédominante sous forme d'imine • l'imine montrait une configuration trans (voir figure 11)

• l'imine était dans un état protoné et l'amine libre sur le carbone C(5) de l'ALA (1) était dans un état non protoné

HOOC

N

NH₂

Enz

H

Figure 11 : Configuration de la base de Schiff selon Jaffe

COOH O

24

Les enzymes co-cristallisées avec l’acide lévulinique (24) apportèrent des informations sur la reconnaissance du groupe carboxylate au site P de l'enzyme [54] [51]_{. L'inhibiteur était lié à}

l’enzyme via une base de Schiff, comme prévue avec la Lys263. Le carboxylate de l’inhibiteur formait des ponts hydrogène avec le groupe OH de la Ser290 et de la Tyr329, et avec l’azote de la chaîne principale de la Ser290 (voir figure 12).

Figure 12 : Reconnaissance du carboxylate via des ponts d'hydrogène avec la Ser290 et la Tyr329 (en noir). Les deux lysines sont aussi représentées : la Lys263, en violet, formant la base de Schiff avec l'acide lévulinique, en bleu, et la Lys210 en vert

La structure de la PBGS ne contenant pas l’inhibiteur présentait un loop entre les résidus 217 et 235 mal défini. Pour la protéine complexée à l’acide lévulinique, tous les acides aminés appartenant à ce loop montraient une densité électronique nettement mieux définie, ce qui pouvait amener à penser que la présence de l’inhibiteur avait un effet d’organisation très marqué. Cette région devenait donc plus ordrée et/ou adoptait une autre conformation en présence du substrat. Elle pouvait donc jouer le rôle d’un lid (couvercle) ouvrant et fermant l’accès au site actif (voir figure 13).

Figure 13 : Superposition de monomères de la PBGS : sans inhibiteur (bleu clair) et complexé à l'acide lévulinique (violet). Le lid est représenté par le ruban en bleu foncé

HOOC COOH O HOOC COOH O O 25 26 COOH NH Enz HN NH₂ HOOC Intermédiaire-clef du mécanisme Jordan I

Figure 14 : Deux composés imitant l'intermédiaire-clef du mécanisme Jordan I

L'analyse des structures contenant l'acide 4-oxo-sébacique (25) et l'acide 4,7-dioxosébacique (26) permit d'avoir une idée plus précise des interactions mises en jeu aussi bien au site P qu'au site A [52] [55]_{. En effet, ces deux composés étaient deux diacides comportant un}

squelette de dix atomes de carbones. Cette structure imitait l'intermédiaire-clef postulé dans le mécanisme de Jordan I (voir figure 14). Les deux groupes carboxyliques étaient à une distance idéale pour pouvoir interagir, de manière simultanée, aux deux sites de reconnaissance de l'enzyme [65]_{. De manière similaire à l'acide lévulinique (24), la}

reconnaissance du groupe carboxylate au site P s'effectuait via la Ser290 et la Tyr329. Le lid (résidus 215 à 235) se trouvait sous une conformation nettement plus ordrée une fois l'inhibiteur lié au site actif. La reconnaissance du groupe carboxylate au site A avait lieu via des ponts d'hydrogène avec l'Arg220, l'Arg232 et la Gln236 (voir figure 16). Il est important de noter la formation d'une deuxième base de Schiff avec la Lys210 au site A de l'enzyme

(voir figure 15). Cette deuxième base de Schiff pouvait imiter la formation d'une liaison covalente au site A entre le substrat et la Lys210 de la PBGS.

HOOC COOH

NH-Enz Enz-HN

Figure 15 : Formation d'une double base de Schiff avec le composé 4,7-dioxosébacique (26)

Figure 16: Reconnaissance du carboxylate au site A et au site P par complexation de la PBGS avec l'acide 4,7-dioxosébacique (26) en bleu. Au site P, le carboxylate forme des ponts d'hydrogène avec la Ser290 et la Tyr329 (en noir), au site A avec l'Arg220, l'Arg232 et la Gln236 (en noir). Les deux lysines sont aussi représentées : la Lys263, en violet, et la Lys210, en vert, formant la double base de Schiff avec l'acide 4,7-dioxosébacique (26) en bleu

3.3.2 L'organisation des ions métalliques au site actif de la PBGS : comparaison