Démarche de biologie moléculaire

2.1.3.1 Protocoles d’extraction des acides nucléiques

Extraction d’ADN génomique (ADNg). Le protocole utilisé pour l’isolement de l’ADN génomique a nécessité la préparation préalable d’une solution de lyse cellulaire au CTAB (Cethyl Trimethyl Ammonium Bromide) composée d’une concentration finale de 100 mM de Tris-HCl et de 20 mM d’EDTA (Ethylene Diamine Tetra acetic Acid) ajustés à pH8, de 1,4 M de NaCl, de 2 % CTAB (m/v) et de 0,02 % (v/v) de -mercaptoéthanol ajouté extemporanément pour chaque session

43 d’extraction. Les échantillons de 50 mg à 1 g de tissu musculaire, ou les organismes entiers pour les plus petits, ont été broyés dans un mortier stérile réfrigéré en présence d’azote liquide. Le broyat a ensuite été transféré dans des tubes stériles contenant 0,5 à 5 mL de solution de CTAB (en fonction de la masse des échantillons) préalablement incubé à 65°C. Chaque milieu a été incubé à 37°C pendant 30 min, puis additionné d’un volume équivalent d’un mélange de chloroforme et d’alcool isoamylique (24 : 1) afin d’en isoler l’ADNg. Après agitation, chaque échantillon a été centrifugé 10 min à 15000 g et la phase aqueuse supérieure a été prélevée dans un nouveau tube. Cette étape a été effectuée une seconde fois pour éliminer d’éventuels résidus cellulaires. La précipitation de l’ADNg a été effectuée à froid (plusieurs heures à -80°C) après addition d’acétate de sodium γM (1/10ème v/v) et d’éthanol absolu (2v/v). Après une centrifugation de 10 min à 15000 g, les culots d’ADNg obtenus ont été conservés, les surnageants éliminés, et lavés deux fois à l’éthanol 70°. L’excédent d’éthanol a été évaporé à la cloche à vide. Chaque échantillon a été repris dans 50 à 500 µL d’eau distillée ultra-pure stérile. La concentration de chaque extraction a été évaluée au nanodrop (Thermoscientific ®) par une mesure la densité optique (DO) à 260 nm. Les éventuelles contaminations protéiques ont été évaluées par le rapport de DO 260/280 et l’intégrité des molécules d’ADN a été vérifiée sur gel d’électrophorèse (Figure 2.2). Enfin, les échantillons ont été stockés à 4°C pour éviter toute dégradation due aux cycles de congélation/décongélation.

Extraction d’ARN et synthèse d’ADN complémentaire (ADNc) : Les ARN totaux ont été extraits à partir de 50 mg de tissu branchial, ou à partir de l’intégralité de l’organisme pour les plus petits, et maintenus à 4°C afin de limiter la dégradation des transcrits. Chaque échantillon a été broyé dans un mortier stérile réfrigéré en présence d’azote liquide, puis transféré dans des tubes contenant 1 mL de solution TriReagent (Ambion ®). Les ARN ont ensuite été isolés en ajoutant 100 µL de BCP (1-Bromo-3-chloropropane), après une incubation de γ0 min suivie d’une centrifugation de 15 min à 15000 g. La phase aqueuse a été transférée dans un nouveau tube stérile et les ARN totaux ont été précipités avec 500 µL d’isopropanol. Comme pour l’ADN, les culots ont été obtenus après centrifugation, élimination du surnageant et lavés deux fois à l’éthanol à 70°. Après 5 min sous la cloche à vide, les ARN totaux ont été dilués dans 20 µL d’eau ultra-pure stérile. Le dosage et le contrôle de la qualité des extraits ont également été effectués par mesure de la DO et une migration sur gel d’électrophorèse (Figure 2.2). Les ARN totaux ont été stockés à -80°C ou utilisés immédiatement après extraction pour la synthèse d’ADN complémentaire (ADNc) par transcription inverse (Reverse Transcription). Afin d’éviter toute contamination d’ADN, 1 µg de chaque extraction a été traité à la DNase avec le kit RNase-Free DNase de Promega ® en suivant le protocole du fournisseur. La transcription inverse a été réalisée avec le kit M-MLV Reverse Transcriptase (Promega ®) en présence de 0,5 µL d’hexamères aléatoires concentrés à β5β,5 µM et de 1 µL d’oligodT-RACE. La polymérisation des ADNc s’est déroulée pendant 1hγ0 à 37°C suivie de 5 min à 70°C. Les échantillons ont été stockés à -20°C et utilisés rapidement pour les amplifications PCR.

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Figure 2.2 : Profils électrophorétiques d’ARN totaux et d’ADNg dégradés ou intègres. Les profils d’ARN totaux intacts présentent deux bandes bien définies correspondant aux ARN ribosomiques 28S et 18S (puit 1). L’ADN est visible par la présence d’une bande unique de poids moléculaire élevé (puit 3). Les acides nucléiques dégradés montrent des profils électrophorétiques sous forme de trainée partant du front de migration du gel.

2.1.3.2 Protocoles d’amplifications et de clonages des séquences nucléiques

Conditions d’amplifications par PCR (Polymerase Chain Reaction). Les volumes d’ADN fonctionnels pour l’amplification ont été préalablement optimisés par un test utilisant des amorces spécifiques de l’ubiquitine (Figure 2.3). Les amplifications ont été réalisées avec le kit GoTaq ® G2 flexi DNA polymerase (Promega ®). Pour chaque réaction, 100 à β00 ng d’ADN a été additionné à un mélange de 5 µL de tampon (5X), 2 µL de dNTP (2 mM), 1,5 µL de MgCl2 (25 mM), 0,12µL de Taq polymérase et 1,5 µL de chaque amorce (10 pmol.µL-1). De l’eau ultra-pure stérile a été ajoutée à chaque milieu réactionnel pour un volume final de 25 µL. Le programme d’amplification du thermocycleur a consisté en une phase de dénaturation de 5 min à 94°C, suivie de 35 cycles de dénaturation (45 s à 94°C), hybridation (45 s à Tm) et élongation (45 à 120 s à 72°C), et d’une étape terminale d’élongation de β min 30 s à 72°C. Les températures d’hybridation (Tm) ont été calculées pour chaque couple d’amorces (cf. Annexe 1 et les temps d’élongation ont été ajustés en fonction de la taille de l’amplicon. Les échantillons ont été accompagnés d’un témoin négatif (contenant de l’eau à la place de la matrice d’ADN) pour chaque couple d’amorces utilisé, afin de s’affranchir de biais de contaminations extérieures. Un témoin positif (contenant de l’ADN fonctionnel) a également été ajouté pour vérifier le bon déroulement de l’amplification PCR. Chaque bande amplifiée a ensuite été révélée au transilluminateur Ultra-Violet après une électrophorèse sur gel d’agarose 1 % en présence BET (Bromure d’éthidium). Les tailles des amplicons attendues ont été comparées avec un marqueur de taille adéquat. En plus des amplifications PCR classiques avec des amorces spécifiques aux gènes de HSP70 cytosoliques, des amplifications en γ’ RACE-PCR (rapid amplification of cDNA-ends by polymerase chain reaction) ont été réalisées pour obtenir les parties terminales γ’ des fragments obtenus. Cette méthode consiste à ajouter une cassette RACE (Annexe 1) aux oligodT lors de la synthèse des ADNc à partir des ARN messagers. Les amplifications PCR ont ensuite été réalisées avec une amorce spécifique au gène de HSP70 recherchée (sens forward) et une amorce complémentaire à la cassette RACE (sens reverse).

45 Figure 2.3 : Principe de l’optimisation des volumes fonctionnels par des amplifications d’ubiquitine. Le gène de la polyubiquitine est composé d’une répétition de séquences de 228 pb codant chacune pour un monomère d’ubiquitine (à droite). L’utilisation des amorces Ubi1 (flèches bleues) et Ubi2 (flèche rouge) montrent des profils d’amplification en échelle d’une ou plusieurs unités d’ubiquitine (à gauche). Les puits 2 à 5 sont chargés de 4 échantillons d’ADNc purs et les puits 7 à 10 sont chargés de ces mêmes échantillons dilués au 1/10ème (puit 1 : témoin négatif, puit 6 : marqueur de taille). Les échantillons trop concentrés (puit 3) ou dégradés ne présentent pas d’amplification, alors que les concentrations optimisées d’ADNc de bonne qualité montrent des bandes d’approximativement à 230 pb, 460, 690, etc.

Protocoles de vectorisation et de clonage : Chaque bande obtenue à la taille attendue a été découpée du gel d’agarose avec une lame stérile. Les élutions des amplifications ont été réalisées avec le kit QIAEX II gel extraction kit (QIAGEN ®) en suivant le protocole indiqué par le fournisseur. Une fois extraites du gel d’agarose, les fragments ont été ligués à 4 °C pendant 16 heures avec le kit pGEM®-T Vector System I de Promega®. Le milieu réactionnel est composé de 5 µL de tampon 2X, de 1µL de T4 DNA ligase (3 unités) et de 1 µL de plasmide (50 ng), finalement additionnés de γ µL d’élution d’ADN. Les 10 µL de produit de ligation sont ensuite ajoutés à 100 µL de culture de bactéries compétentes (Escherichia coli de type NEB-5α). Le plasmide a été transfecté dans les bactéries par choc thermique à 42 °C pendant 30 s, puis les cultures ont été placées dans la glace pour que les pores pariétaux des bactéries se referment et retiennent le plasmide. Chaque tube de culture a été incubé sous une agitation douce pendant 60 min, après avoir été enrichi avec 250 µL de milieu de culture LB (Luria Bertani) liquide (composition en Annexe 3). La séquence du vecteur transfecté permet une sélection en deux temps des bactéries recombinantes. D’une part, la présence d’ampicilline dans le milieu permet de sélectionner les bactéries ayant intégré le vecteur plasmidique, contenant le gène de résistance à cet antibiotique. D’autre part, le vecteur pGEM-T® contient le gène de la -galactosidase incluant le site multiple de clonage (MCS, Multiple cloning site). La présence de l’insert dans le plasmide inhibe donc la production de l’enzyme dans les clones à sélectionner, reconnaissables par des colonies blanches en présence de X-gal (Bromo-5-chloro-4-indolyl-3-β-D-galactopyranoside). En effet, la dégradation du X-gal produit un réactif coloré et les bactéries capables de produire la -X-galactosidase (contenant le vecteur non recombiné) apparaissent donc bleues. Les boîtes de pétri sélectives sont préparées avec un milieu LB solide (Annexe 3) additionné de 60 µL d’ampicilline (50 mg.mL-1), de 50 µL de X-gal (2 %) et de 10 µL d’IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, 400 mM) un inducteur de la -galactosidase. Les boîtes sont inoculées avec 100 µL de culture bactérienne puis incubées à 37 °C pendant 16 heures. Les clones sélectionnés sur les boîtes sont finalement repiqués dans 500 µL de milieu LB liquide, additionné de β µL d’ampicilline pour éviter les contaminations. Après avoir incubé les tubes sous agitation à 37 °C durant 6 heures, les tailles des séquences clonées sont vérifiées par PCR avec des

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amorces communes correspondant à des séquences T7P et SP6 proches du MCS. Les produits de PCR sont visualisés sur gel d’agarose, et les clones donnant des profils électrophorétiques satisfaisants ont été sélectionnés pour l’extraction du plasmide recombinant correspondant (kit Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System, Promega®). Les concentrations des plasmides extraits ont été mesurées par densité optique (DO260) au nanodrop, puis séquencés (GENEWIZ Beckman Coulter Genomics).

Le déroulement global de la démarche de biologie moléculaire est schématisé Figure 2.4.

Figure 2.4 : Schéma général de la démarche de caractérisation des fragments de hsp70.