Comparaison des séquences régulatrices

Mis à part les modèles biologiques communément étudiés, les HSP70 cytosoliques sont généralement classées dans la littérature en fonction de leur modalité d’expression constitutive (HSC70) ou inductible (HSP70). Dans certaines études, le caractère constitutif ou inductible des HSP70 est même déduit a priori à partir de similarité entre séquences appartenant à des infraordres distincts, considérant ainsi que les HSC70 et HSP70 forment deux sous-familles distinctes (Liu et al., 2004; Mestre et al., 2015; Qian et al., 2012). Cependant, les modalités d’expression de la HSP70 semblent relever avant tout de la structure de leur promoteur ou plus largement de leur séquence régulatrice, et aucune corrélation générale n’a encore été mise en évidence entre la structure des HSP70 et leur expression. Cette partie s’intéressera donc à la structure des séquences régulatrices pour les différents groupes de HSP70, afin de déterminer si les promoteurs sont conservés au sein des différents groupes de HSP70 cytosolique décrits.

Les séquences choisies pour ces analyses ont été sélectionnées parmi les données de génomes séquencés de chélicérates (Ixodes scapularis et Tetranychus urticae) et d’hexapodes (Drosophila melanogaster, Bombyx mori et Plutella xylostella). En effet, aucun assemblage de génome de malacostracé n’est encore suffisamment aboutit pour ce type d’analyse structurale (faible taille des fragments assemblés).

73 Les analyses ont été effectuées à partir de séquences remontant sur 3000 pb maximum en amont de l’ORF (Open Reading Frame). Les séquences régulatrices ont été soumises à la plateforme AliBaba2 (Grabe, 2002) pour identifier les sites de fixation de facteurs de transcriptions, répertoriés dans la base de données TRANSFAC 4.0 (Wingender et al., 1996). Les recherches se sont limitées à la détection des boîtes CCAAT, des sites de fixation des HSF (Heat Shock Factor), correspondant aux HSE (Heat Shock Element), et des facteurs de transcription NFκB (Nuclear factor kappa B), impliqués dans l’induction des gènes de HSP70 (Chuang et al., 2007).

Les recherches ont tout d’abord été effectuées sur les promoteurs associés aux HSP70 cytosoliques de Drosophila melanogaster, dont la diversité et les profils d’expression ont été largement étudiés. Les HSC70-1 et HSC70-4 sont constitutives et rassemblées dans le groupe AB, tandis que les différentes HSP70 et la HSP68, groupées avec les HSP70 C, sont induites par une augmentation de la température (Palter et al., 1986). Cette première analyse a eu pour objectif de comparer les structures régulatrices des gènes constitutifs et inductibles de HSP70 (Figure 3.8). Les gènes inductibles de D. melanogaster présentent β à γ HSE dans les 600 pb en amont de l’ATG. Le groupe de HSP70 annotées Ba, Bb et Bc possède également 1 à 2 sites de fixation de NFκB (en position -660 à -956), un facteur de transcription impliqué dans de nombreuses voies de communication cellulaire dont les réponses au stress, les réponses immunitaires et l’apoptose (signal pro-apoptotique). Néanmoins, les sites de fixation de NFκB, ainsi que les boîtes CCAAT ne semblent pas indispensables au caractère inductible de la HSP70 Ab. Le promoteur du gène de la HSP68 possède également 2 sites de fixation NFκB mais uniquement un HSE dans les 1000 pb en amont de l’ATG.

Les promoteurs des gènes de HSC70 présentent également de nombreux éléments inducteurs de l’expression, mais plus éloignés du codon initiateur. La présence d’un HSE proche de l’ATG (position -384) a d’ailleurs été constatée dans la région promotrice de la HSC70-1. Cet unique HSE ne semble cependant pas suffisant pour l’induction du gène. La présence et la localisation des éléments régulateurs plus éloignés, au-delà de -1000 pb, sont particulièrement variables d’une séquence à l’autre. Des expériences de fonctionnalité pour chaque promoteur sont donc nécessaires pour évaluer leur degré d’implication dans l’expression des gènes associés.

3

C

HSP70

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Figure 3.8 : Schéma des régions régulatrices pour les différents gènes de HSP70 de Drosophila

melanogaster. Les liens de parenté entre chaque séquence protéique correspondante ont été déduits des

analyses phylogénétiques de HSP70 chez les arthropodes (Figure 3.3) et les hexapodes (Figure 3.6).

Les séquences régulatrices associées à différents gènes de chélicérates et d’hexapodes ont ensuite été analysées, afin de détecter d’éventuelles particularités structurales communes pour chaque groupe de HSP70 et comparables à celles des promoteurs constitutifs ou inductibles des gènes de D. melanogaster. Les séquences des trois formes de HSP70 : AB I, AB II et AB III de Tetranychus urticae ont été choisies car elles semblent être apparues tardivement dans l’évolution (cf. partie 3.2.2.3), et leur promoteur pourrait donc être conservé pour ces différentes formes. Les analyses ont également été réalisées sur des séquences de Bombyx mori et Plutella xylostella, afin d’évaluer si les séquences régulatrices peuvent être conservés pour un même type de HSP70 au sein d’un même infraordre (Neolepidoptera). De même, plusieurs séquences appartenant au même groupe de HSP70 ont été analysées afin d’évaluer la variabilité des séquences régulatrices au sein d’une espèce. Enfin, les séquences de HSP70 AB et HSP70 C d’Ixodes scapularis ont été ajoutées à l’analyse pour observer une éventuelle conservation des structures promotrices associées aux HSP70 AB et C dans le phylum Arthropoda. Les relations de parenté entre les différentes séquences utilisées sont représentées dans un arbre, définit à partir des analyses phylogénétiques chez les arthropodes, chélicérates et hexapodes (cf. partie 3.2.2). Les structures des séquences régulatrices et les relations de parenté des séquences associées sont représentées Figure 3.9.

75 Figure 3.9 : Schéma des structures des régions régulatrices pour les différents gènes de HSP70 décrits chez les chélicérates et hexapodes. Les espèces étudiées sont Ixodes scapularis et Tetranychus urticae (Chelicerata) ainsi que Bombyx mori et Plutella xylostella (Hexapoda). Les liens de parenté entre chaque séquence protéique correspondante ont été déduits des analyses phylogénétiques de HSP70 chez les arthropodes (Figure 3.3), les chélicérates (Figure 3.5) et les hexapodes (Figure 3.6).

A l’instar des structures observées chez D. melanogaster, seules les séquences du groupe C présentent plusieurs HSE dans les 500 pb en amont de l’ORF. Cependant, le promoteur de la séquence HSP-D1890A2 (groupe C) ne présente aucun HSE à proximité de l’ATG, caractéristique de l’inductibilité des gènes de HSP70 chez la drosophile. Dans le groupe AB, une des séquences promotrices (HSP-D1965B23) ne présente aucun HSE. La présence de ces éléments conditionne l’induction des gènes de HSP70 (Shopland and Lis, 1996), on pourrait alors supposer que HSP-D1965B23 est constitutive. A l’opposé, les séquences HSP-D1953B31 et HSP-D1983A2 présentent à la fois un HSE et un site de fixation de NFκB à proximité de l’ORF, structure également retrouvée dans la région promotrice de la HSP68 inductible de drosophile. Ces différentes structures promotrices ne permettent donc pas de présupposer d’un caractère constitutif ou inductible commun aux HSP70 AB ou aux HSP70 C.

Chez T. urticae, aucune HSP70 C n’a été mise en évidence, les séquences étant divisées en γ groupes parmi les HSP70 AB. Bien que leurs séquences régulatrices présentent toutes des boîtes CCAAT et des sites de fixation de NFκB dans les 1000 pb en amont de l’ATG, chaque groupe se

3

C

HSP70

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distingue nettement par leurs HSE. La séquence régulatrice associée aux HSP70 AB III présente 2 HSE à proximité de l’ORF, celle associée aux HSP70 AB II présente des HSE éloignés, au-delà de la position -1000 (par rapport à l’ATG), tandis que celle des gènes de HSP70 AB I n’en possède aucun. Ces différences importantes de structure permettent de supposer que ces 3 formes, relatives au même groupe AB, pourraient également avoir des modalités d’expressions distinctes. De plus, les séquences de HSP70 C issues d’espèces proches (B. mori et P. xylostella, Neolepidoptera), comme les séquences « en doublon », (issues d’une seule espèce et classées dans le même groupe de HSP70), présentent également des variations notables de structure dans leurs séquences régulatrices. Les régions régulatrices des gènes de HSP70 diffèrent donc chez des organismes appartenant au même infraordre ou à la même espèce.

L’analyse structurale du promoteur n’est pas suffisante pour déduire le caractère constitutif ou inductible d’un gène. L’intervention de régions régulatrices distales et de nombreux autres éléments non relevés dans ces analyses, comme l’élément GAGA (Shopland et al., 1995), les boîtes TATA et GATA (Lee et al., 2003), ou la richesse en AT des séquences séparant les HSE (Chen et al., 2011) peuvent également influencer l’expression des gènes de HSP70.

De plus, l’étude précise de fonctionnalité d’un promoteur nécessite des expérimentations, comme par exemple l’analyse de l’expression du gène avec des portions tronquées de sa région régulatrice. Cependant, les structures promotrices observées ne sont pas suffisamment conservées dans chaque groupe pour supposer a priori du caractère constitutif ou inductible des gènes associés aux HSP70 AB et HSP70 C. Bien au contraire, la variabilité de leurs régions régulatrices favoriserait l’hypothèse de modalités d’expression diversifiées au sein de chaque groupe de HSP70.