Comparaison des structures primaires

Pour la comparaison des séquences protéiques, des alignements multiples ont été effectués en utilisant la plateforme MAFFT (http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/ ; (Katoh and Standley, 2013). Les pourcentages d’identité ont été calculés pour chaque paire de séquences via le logiciel Genedoc (Nicholas et al., 1997). Les profils d’hydrophobicité ont été réalisés avec l’outil protscale (Gasteiger et al., 2005) avec la méthode Kyte et Doolittle (1982) via la plateforme d’Expasy (http://web.expasy.org/protscale/).

Une sélection de 35 séquences représentatives des HSP70 AB et C (chélicérates et hexapodes), ainsi que des HSP70 A et B (malacostracés) a été utilisée pour la comparaison des pourcentages d’identité des séquences protéiques (Tableau 3.3). Globalement, les différentes HSP70 cytosoliques présentent un minimum de 65 % d’identité entre elles, pour l’ensemble des espèces étudiées. Les séquences appartenant au groupe C sont aussi proches de celles constituant le groupe AB que le groupe A (67 à 7γ % d’identité). Les séquences des groupes A et B présentent logiquement plus d’identité avec le groupe AB (71 à 86%) qu’avec le groupe C (65 à 7γ%).

A l’intérieur de chaque groupe, les HSP70 C semblent aussi diversifiées que les HSP70 AB avec respectivement 7β et 74 % d’identité minimum entre séquences. En revanche, chez les malacostracés, le groupe A est plus conservé que le groupe B avec respectivement 8β et 76 % d’identité minimum entre séquences. L’étude plus précise des pourcentages d’identité parmi les HSP70 d’astacidés montre que les séquences du groupe B1 sont aussi proches des HSP70 A1 et A2 (77 à 79%) que des HSP70 B2 (76 à 78%). Pourtant le groupe B est particulièrement bien soutenu par les analyses phylogénétiques, et la

77 proche parenté des groupes B1 et B2 ne fait aucun doute. La diversité des HSP70 cytosoliques ne peut donc pas être uniquement expliquée par de simples identités de séquences.

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C

HSP70

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Tableau 3.3 : Comparaison des pourcentages d’identité des séquences protéiques de HSP70 pour différents groupes décrits. Les séquences ont été sélectionnées parmi les HSP70 AB et C de chélicérates (Tetranychus urticae et Ixodes scapularis) et d’hexapodes (Bombyx mori, Drosophila melanogaster et Plutella xylostella), ainsi que les HSP70 A1, A2, A3, B1 et B2 de malacostracés (Astacus astacus, Cancer borealis, Euphausia crystallorophias et Homarus americanus).

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C

HSP70

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Des alignements multiples de séquences protéiques de HSP70 cytosoliques ont été réalisés pour chaque taxon, afin de définir des motifs propres aux différentes formes. Ces motifs sont représentés (Figure 3.10) et détaillés dans les tableaux (Annexe 6). Les régions variables sont principalement localisées dans le NBD (Nucleotide Binding Domain), l’interdomain linker et le CTD (C-Terminal Domain). La plupart des motifs identifiés permettent à la fois la discrimination des groupes A et B des malacostracés (Figure 3.10 A) et celle des groupes AB et C de chélicérates et d’hexapodes (Figure 3.10 B). Les séquences appartenant aux groupes AB et C sont plus variables. Cela s’explique par le fait qu’ils incluent plus de taxa.

Dans le NBD, le résidu en position 113 présente une tyrosine dans les groupes A1 et A2, et une phénylalanine pour le groupe A3, remplacée par une asparagine dans le groupe B. On retrouve cette distinction avec une tyrosine, une phénylalanine ou une cystéine dans le groupe AB et une alanine, une asparagine ou une sérine à la même position dans le groupe C. Le NBD présente aussi des insertions de 2 acides aminés pour les groupes B1 et AB et de 4 acides aminés pour le groupe B2 en position 188. Une insertion supplémentaire en position 213 est observée dans le groupe C. L’interdomain linker est également remanié dans les différents groupes, notamment par le remplacement de 2 leucines par des valines dans le motif DLLLLDV, pourtant très conservé chez les eucaryotes (Alderson et al., 2014).

Le CTD est le domaine présentant la plus grande variabilité intergroupe. En effet, il présente un réarrangement d’acides aminés chargés (position 561 à 575). De plus, l’extrémité C-terminale des HSP70 du groupe A est caractérisée par une zone riche en glycine, méthionine et proline, caractérisée par un motif GGXP répété. Dans le groupe AB les répétitions GGXP apparaissent dans une majorité de séquences, alors qu’elles sont beaucoup plus rares dans le groupe C. La variabilité de la longueur des HSP70 (cf. partie 3.3.1.1) est directement liée à la structure du CTD, pouvant inclure le motif GGXP répété jusqu’à 1γ fois (Figure 3.11).

Les motifs discriminants entre les différentes formes de HSP70 sont localisés dans la première moitié du NBD, au niveau de l’interdomain linker et tout au long du CTD. Le SBD, zone de fixation des protéines cibles, est quant à lui bien conservé pour chaque forme de HSP70. On peut donc supposer que les différentes HSP70, malgré leur diversité, agissent sur un même ensemble de protéines clientes.

Figure 3.10 : Localisation des motifs discriminants pour les différents groupes de HSP70. Les motifs discriminants des groupes A et B de malacostracés sont présentés figure A, tandis que ceux des groupes AB et C des chélicérates et hexapodes sont présenté figure B.

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C

HSP70

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Figure 3.11 : Alignement de deux séquences de longueurs extrêmes, la plus courte et la plus longue, parmi les HSP70 du jeu de données. La séquence la plus courte, de 620 acides aminés est codée par un gène de 1866 pb (Acanthoscurria geniculata), tandis que la séquence la plus longue, de 685 acides aminés est codée par un gène de 2055 pb (Bombyx mori). Ces différences de longueur sont dues à une variabilité du CTD et à l’absence/présence du motif GGXP répété ici 13 fois.

Afin de déterminer l’impact de ces motifs discriminants, des profils d’hydrophobicité ont été réalisés à partir des HSP70 de l’écrevisse Astacus astacus, espèce pour laquelle chaque forme est représentée par une séquence complète (Figure 3.12). Les profils d’hydrophobicité semblent similaires pour les HSP70 A1 et A2. Cependant, les formes A, B1 et B2 montrent des variabilités sensibles d’hydrophobicité au niveau de leurs CTD. En effet, même si les profils des HSP70 A et B2 semblent identiques, l’hydrophobicité du CTD de Bβ fluctue de façon plus importante le long du domaine. La première flèche indique une diminution inférieure à -2,5, alors qu’elle est de -2,25 environ pour les formes A. Entre les 520ème et 600ème acides aminés, l’hydrophobicité augmente jusqu’à atteindre 0 pour la forme Bβ (deuxième flèche), alors qu’elle n’atteint qu’un maximum de -0,5 chez les HSP70 A. De plus, les 50 résidus de l’extrémité terminale de la forme B2 (troisième flèche) sont globalement plus hydrophobes (-0,5 à -1) que celles des formes A1 et A2 (0 à -0,5). Pour la HSP70 B1, on observe un profil très différent des autres types de HSP70 dans le CTD. Un pic est observé aux environs de la position 550, représentant une zone particulièrement hydrophobe (maximum de +0,5). De plus, les 50 derniers acides aminés de la HSP70 B1 maintiennent une hydrophobicité globalement plus importante au niveau de l’extrémité C-terminale que les HSP70 A.

81 Figure 3.12 : Profils d’hydrophobicité (A) et alignement (B) des formes HSP70 A1, A2, B1 et B2 d’Astacus astacus. Les profils d’hydrophobicité sont représentés par des scores en fonction de la longueur de la séquence analysée. Les zones discriminantes sont indiquées par des flèches (A) ou encadrées en rouge (B).

En conclusion, les sites discriminants des différentes formes de HSP70 n’ont pas tous le même impact sur leurs profils d’hydrophobicité. Alors que chaque type de HSP70 présente des profils équivalents pour le NBD et l’interdomain linker, les valeurs d’hydrophobicité du CTD sont très variables d’une forme à l’autre. Les formes HSP70 A possèdent une extrémité C-terminale globalement plus hydrophobe, due à la répétition du motif GGXP ou plus largement à une forte concentration de glycines et de prolines dans cette partie de la séquence primaire. La localisation des motifs discriminants au niveau des structures secondaires et tertiaires permettra, dans la partie suivante, d’associer ces particularités structurales aux conformations tridimensionnelles des différents types de HSP70.

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