3. Matériels et méthodes
3.2. Méthodes
3.2.1. Dégradation des éprouvettes par les champignons
3.2.1.1. Préparation des échantillons de bois
Les éprouvettes de hêtre, de pin et du chêne soyeux ont toutes été préparées de la même manière. Leurs dimensions sont de 25 x 15 x 5 mm selon les directions longitudinale, radiale et tangentielle respectivement. Elles sont par la suite poncées, numérotées et misent à sécher à 55°C durant 48 heures afin de prévenir une possible dégradation des extractibles, avant d’être
pesées (m0).
Deux fongicides (figure 31) fournis par la société Dyrup (Albi ; France) ont été utilisés dans cette étude afin de limiter ou d’inhiber la dégradation du bois par les champignons.
Biocides utilisés :
Le propiconazole
(1-[[2-(2,4-dichlorophenyl)-4-propyl-1,3-dioxolan-2-yl]methyl]-1,2,4-triazole) est un fongicide de la famille des triazoles. Il agit préventivement et curativement sur une vaste gamme de champignons et bactéries (Petrie 1995 ; Mueller et al., 2004). Il provoquent l'inhibition d'enzymes impliquées dans la synthèse des stérols comme l’ergostérol, entraînant une perturbation du fonctionnement et de la formation des membranes cellulaires des champignons.
L’IPBC (3-iodo-2-propynyl-N-butyl carbamate), est comme de nombreux carbamates, très utilisé en combinaison avec d’autres produits dans des formulations de préservation. En combinant l’IPBC au DDAC (didecyl dimethyl ammonium chloride) Xiao à ralenti voir inhibé, la germination des spores de Ophiostoma picea (Xiao et Kreber 1999). L’IPBC utilisé à grande échelle peut être très toxique pour les organismes aquatiques (Juergensen et al., 1999).
I O O NH CH3 IPBC Cl Cl CH2 O O CH2CH2CH3 N N N Propiconazole
Figure 31 : Biocides utilisés durant cette étude
Détermination des concentrations minimales inhibitrice (C M I) et non inhibitrice
Des solutions de 100 mL de propiconazole et d’IPBC ont été préparées à différentes
concentrations (3.10-2 , 10-2 , 3.10-3 , 10-3 , 3.10-4 et 10-4 M) dans de l’éthanol 95%. Dans un
premier temps, ces gammes de concentrations ont été testées afin de déterminer les concentrations minimales inhibitrices permettant d’inhiber la dégradation des échantillons de bois pour une essence donnée et une champignon donné. La concentration minimale inhibitrice (C M I) est validée lorsque les pertes de masses des échantillons au bout de 3 mois de dégradation sont inférieures à 3%. A des concentrations inférieures à la concentration
minimale inhibitrice, la croissance du champignon peut être légèrement ralentie.
3.2.1.2. Méthode d’imprégnation
Les éprouvettes réparties par essence sont placées dans un béchers de 500 mL et recouvertes de grilles sur lesquelles sont placées des billes de verre pour les empêcher de flotter lors de l’imprégnation des différentes solutions de fongicides. Le bécher est ensuite placé dans une cloche à vide, munie d’un robinet double voie (figure 32). L’air contenu à l’intérieur des éprouvettes est alors éliminé grâce à une pompe à palette et un vide de 5 mbar
maintenu à l’intérieur de la cloche pendant 20 minutes. Les solutions à différentes
concentrations de propiconazole et d’IPBC sont préparées à raison de 350 mL par concentration. Avant l’imprégnation, ces solutions sont passées au bac à ultrasons durant 5 min. La connexion avec la pompe est fermée après un vide de 20 minutes et la solution de traitement est alors introduite par aspiration jusqu’à ce que les éprouvettes soient totalement recouvertes. Les éprouvettes témoins quant à elle sont imprégnées avec de l’éthanol à 95%.
Le tableau 2 décrit les différentes imprégnations réalisées en fonction des essences et des concentrations de solutions de préservation utilisées. Après retour à la pression atmosphérique, l’ensemble est laissé au repos pendant deux heures, les éprouvettes sont ensuite égouttées, laissées à l’air libre durant 24 heures.
Tableau 2 Nombre d’échantillons utilisés en fonctions des concentrations des fongicides durant 30 jours et 3 mois de dégradation
Fagus sylvatica Pinus sylvestris Grevillea robusta
Concentration
30jours 3 mois 30jours 3 mois 30jours 3 mois
propiconazole 10-2 M 144 24 48 8 144 24 10-4 M 144 24 48 8 144 24 IPBC 10-2 M 144 24 48 8 144 24 3.10-4 M 144 24 48 8 144 24 Témoin éthanol à 95% 144 24 48 8 144 24 Total 720 120 240 40 720 120
3.2.1.3. Confrontation des éprouvettes aux champignons
40g de malt et 30g d’agar sont dissous dans un litre d’eau distillée. Le mélange est homogénéisé par chauffage de la solution au alentour de 50°C. Le pH du mélange est ajusté à 4,8 à l’aide d’une solution d’acide chlorhydrique (0,5N). Le mélange est ensuite stérilisé à l’autoclave à 120°C pendant 25 minutes. Après refroidissement, le mélange stérilisé encore tiède (environ 40°C) est coulé à raison de 20 mL environ dans les boîtes de Pétri de 8,5 cm de diamètre sous une hotte à flux laminaire à proximité d’une flamme. Les boites sont ensuite laissées une heure sous la hotte de façon à laisser le milieu se solidifier.
Dans des conditions stériles (hotte à flux laminaire et à proximité d’une flamme), les boîtes de Pétri sont inoculées par un morceau de mycélium introduit au centre du milieu gélosé. Les boites de Pétri sont placées dans une enceinte climatique de marque Binder KBF 115 régulée à 22°C et 70% H R et laissé pendant une semaine de façon à permettre la colonisation de toute
la surface de la boite par le mycélium.
Les différentes éprouvettes sont stérilisées par groupes de même essence après exposition durant 15 minutes par côté aux UV. Les éprouvettes stérilisées sont alors mises au contact du champignon sous conditions stériles, et les boites de Petri sont fermées avec du parafilm. Les éprouvettes de hêtre sont exposées à Trametes versicolor, Gloeophyllum trabeum et Coniophora puteana ; les éprouvettes de pin à Poria placenta et celles d chêne soyeux à Trametes versicolor, Phanerochaete chrysosporium et Antrodia sp.. Après avoir placé les éprouvettes sur le milieu de culture, ces dernières sont laissées à incuber pendant des durées variables dans une enceinte climatique à 22°C et 70% H R (figure 33). Chaque essais est réalisé en double à raison de quatre éprouvettes par boite de Pétri. Deux séries d’essais ont été réalisées : une première série dans laquelle, les éprouvettes sont retirées tous les cinq jours pendant un mois et une deuxième série ou les éprouvettes sont laissées incuber pendant trois
mois.
A la fin de la période d’incubation, les éprouvettes sont retirées des boites de Petri,
débarrassées du mycélium et pesées (m1). Les éprouvettes sont ensuite séchées à 55°C durant
48 heures puis pesées (m2). Les pertes de masses et l’humidité des échantillons sont ensuite
déterminées par les formules ci-dessous.
où m0 est la masse initiale des échantillons séchés à 55°C et m2 la masse des échantillons séchés à 55°C après exposition au champignons.
Humidité (%)= [(m1-m2)/m2] x 100
où m1 la masse des échantillons non séchés et débarrassés du mycélium et m2 la masse des
échantillons séchés à 55°C après exposition au champignons.
Figure 33 : Enceinte climatique
Dans le cas des essais réalisés pendant trois mois et par analogie avec la norme EN 113, les différents résultats peuvent être considérés comme valides si les éprouvettes témoins présentent des pertes de masses supérieurs à 20 % après confrontation aux champignons. Les éprouvettes traitées sont considérés comme résistantes à la dégradation des champignons basidiomycètes, si les pertes de masses moyennes de chaque groupe d’éprouvettes (pour une essence donnée, un champignon donné et un traitement donné) sont inférieure à 3% et si une éprouvette d’essai au maximum a subi une perte de masse supérieure à 3% mais inférieure à 5%.