Analyses des extractibles

2.3.3.1. La résonance magnétique nucléaire

L’utilisation de la RMN pour l’identification des extractibles peut se faire en utilisant soit la

RMN du carbone¹³ , soit la RMN du proton qui sont des techniques complémentaires.

L’isolation et la purification préalable des molécules, a permis d’identifier de nombreux composés. Ainsi, des acides triterpéniques permettent de lutter contre le cancer de la prostate, ont été isolés du Prunus africana (Fourneau et al., 1996). L’utilisation combinée de méthodes

analytiques et de techniques RMN (H¹ et C¹³), a permis d’identifier de nombreux extraits

phénoliques du bois et des feuilles de Grevillea Robusta impliqués dans la lutte contre le HIV-1 (Ahmed et al., 2000 ; Mburu 2007). Des composés tels que des glycosides de chalcones ou de stilbenes glycosides ont pu être isolés et identifiés par RMN à partir de l’écorce de Guillotinade tessmanii, plante très utilisée en médecine traditionnelle en Afrique centrale (Fuendjiep et al., 2002).

Afin d’éviter, ou tout au moins de réduire les étapes fastidieuses de purification pour l’analyse d’un mélange complexe, une méthode d’identification des constituants de mélanges naturels,

basée sur l’analyse de spectres RMN du carbone ¹³ a été mise au point et développée par

l’équipe « Chimie et Biomasse » de l’Université de Corse (Bradesi et al., 1996 a et b). Cette méthode d’analyse, couplée ou non à une méthode GC/MS, permet de caractériser la composition de nombreuses huiles essentielles (Mariotti et al., 1997 ; Filippini et al., 2000 ; Baldovini et al., 2001). Elle a également permis d’analyser la variabilité chimique de diverses

plantes comme Thymus herba-barona, Thymus carnosus, T. caespititius et T. camphoratus (Salgueiro et al., 1995 et 1997 ; Corticchiato et al., 1998).

2.3.3.2. Chromatographie en phase gazeuse

La chromatographie en phase gazeuse permet d’opérer, la séparation de composés volatils ou rendus volatils de mélanges très complexes, et une analyse quantitative des résultats à partir d’un volume d’injection réduit. Malgré tout, ceci ne peut suffire à une bonne identification sans l’apport du couplage entre la GC et une technique d’identification spectroscopique: en général la spectrométrie de masse (GC/MS) (De Hoffmann 1999 ; Constantin 1996).

L’utilisation de la GC, a permis selon les travaux de Fernandes de séparer les composés présents dans Populus tremuloides. Dans ce travail, les auteurs ont isolé plus de 70 composés dont des stérols, des di et triglycérides et des flavonoïdes. De plus, 44 de ces composés ont pu être identifiés (Fernandez et al., 2001).

Pour des composés peu volatils renfermant des groupements hydroxyle, il est nécessaire d'avoir recours à une méthode de dérivatisation. Ces méthodes ont pour but de contourner les problèmes dus aux interactions de type liaisons d’hydrogène des groupements hydroxyle avec la colonne, en dérivant les composés sous forme d'acétate, d'éther méthylé ou sylilé grâce à différents réactifs. En utilisant comme réactif de dérivatisation le mélange N,O-bis (triméthylsilyl) trifluoroacétamide/triméthylchlorosilane (BSTFA/TMSCl), Zule a déterminé la nature et la concentration des composés présents dans des extraits de hêtre obtenus à l'acétone et à l'hexane (Zule et Moze 2003). Willför et al. en analysant les extraits silylés de nœuds du bois de Picea abies, ont identifié de grandes quantités de lignanes (Willför et al., 2003, 2004). Cependant, l’utilisation de méthodes de dérivatisation dans des conditions acides et avec chauffage, peuvent donner lieu à la formation de produits secondaires et ainsi compliquer l’analyse.

En utilisant la GC couplée à la spectroscopie de masse, Lavoie et Stevanovic ont pu identifier et quantifier différents composés lipophiles et bioactifs des feuilles du bouleau jaune (Betula alleghaniensis), comme de nombreux triterpènes et acides gras. Les abondances de ces différents composés ont étés étudiés en fonction des différentes périodes de l’année (Lavoie et Stevanovic 2005).

La composition chimique du bois de Ceratonia siliqua a été déterminée par GC-MS. L’analyse des fractions méthanolique et aqueuse, a permis d’identifier de l’acide gallique, de la catéchine et différents dérivés de cette dernière, et des monosaccharides (Mualla Balaban 2004).

2.3.3.3. Chromatographie liquide haute performance

Il s’agit d’une méthode de séparation des constituants d’un mélange. Le principe de base de la séparation est le passage d'un liquide à haute pression (phase mobile) contenant l’échantillon au travers d'une colonne (phase stationnaire). La polarité de la colonne ainsi que le type de solvants ont un impact sur la séparation des molécules dû à l'environnement chimique de l'ensemble. L’éluant utilisé peut être une combinaison miscible et variée de solvants (eau, alcools, acétonitrile, dichlorométhane, acide acétique...). Souvent, la composition de la phase mobile est modifiée au cours de l'analyse, c'est le mode dit gradient ou élution graduée en opposition au mode isocratique, pour lequel la composition de la phase mobile reste la même tout au long de l'analyse. En sortie de colonne, chaque constituants est révélé par un détecteur. L'instrumentation de l'HPLC se compose de plusieurs éléments: une pompe, un injecteur, une colonne et un détecteur. Pour ce qui est des détecteurs, il en existe notamment deux très utilisés le détecteur à barrette de diode (PDA) et la spectrométrie de masse (SM). Durant ses dernières années, l’utilisation du détecteur évaporatif à diffusion de lumière (ELSD pour Evaporative Light Scattering Detector) a permis l’analyse de composés non volatiles absorbant ou pas en UV. Le flux de solvant est nébulisé et les gouttelettes formées dans le nébuliseur sont entrainées par le flux de gaz. Les gouttelettes sont alors évaporées pour enlever la phase mobile. Les composés non volatiles présent dans la vapeur de solvant, sont portés par le flux de gaz dans la région de détection. Dans cette zone, un faisceau de lumière croise la vapeur de particules, et la lumière diffusée par les particules est mesurée. L’utilisation de l’HPLC (figure 27) a énormément contribué aux connaissances actuelles dans le domaine de la chimie des extractibles.

Figure 27: Image de l’HPLC utilisée durant notre étude

L’utilisation de HPLC a permis l'identification et la quantification de composés susceptibles de présenter des effets cancérigènes comme l'acide gallique, la quercitine, l'acide ellagique, et la catéchine dans le bois de chêne, de hêtre et de frêne, ont été effectuées par Mâmmela dans le but de trouver des marqueurs chimiques (Mammela et al., 2001 a et b ; 2002). De la même manière, Bergeron a prouvé l’identité et la réelle provenance de Echinacea purpurea et E. angustifolia, deux plantes médicinales, en identifiant différents marqueurs phytochimiques propres à chacune de ces espèces (Bergeron et al., 2000).

La combinaison entre L’HPLC et la RMN a permis à Arramon d’identifier la présence de saponines (triterpène lié à un sucre) dans le bois de cœur de chêne rouvre et pédonculé (Arramon et al., 2002). Après une première séparation sur gel de silice par chromatographie classique, l’ HPLC a permis d'isoler ces constituants et la RMN de les identifier.

Koch a identifié les composés susceptibles d'être à l’origine du changement de couleur du bois de hêtre en utilisant un détecteur à barrette de diode (Koch et al., 2003). Ces composés, dont la catéchine et la 2,6-dimétoxybenzoquinone, ont par la suite été localisés dans les cellules du parenchyme et dans le lumen des vaisseaux. Pensado quant à lui, a quantifié et identifié des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP), polluants très toxiques pour l’environnement en utilisant une détection UV couplée à la fluorescence (Pensado et al., 2000). Appliquée au matériau bois, il a confirmé l’efficacité de sa méthode d’analyse en identifiant différents HAP.

En utilisant le détecteur évaporatif à diffusion de lumière, Claarsen et al ont identifier les composés apolaires contenus dans le bouleau (Betula sp) et le pin (Pinus sylvestris). La

séparation, réalisée sur une colonne de type C₁₈ à permis d’identifier et de quantifier différents

acides gras, triglycérides, stérols et autres acides résiniques (Claassen et al., 2000). L’absence de chromophore chez les saponines, empêche leur bonne détection dans l’ultraviolet. Et possèdent une détection non spécifique à 200–210 nm. L’utilisation du détecteur évaporatif à diffusion de lumière pour la détection des saponines à été développée et validée. Ainsi, en utilisant ce détecteur Chai et al ont déterminé sept saponines chez une plante médicinale (Flos Lonicerae ) en utilisant une colonne C18 (Chai et al., 2005).

L'utilisation de différentes colonnes : échangeuses d'ions, greffée NH₂, greffée C₈ ou C₁₈

conduit à des interactions plus ou moins importantes permettant une meilleure résolution et séparation des pics des composés à analyser. L'analyse des sucres tels que le fructose, le glucose, le sucrose et le lactose ainsi que différents extractibles bioactifs, a été réalisée sur des

colonnes de type NH₂ ou échangeuse d'ions (Von Eggelkrau - Gottanka et al., 2002). Kaar a utilisé une colonne échangeuse d'ions pour quantifier les différent monosaccharides de divers bois et montrer que le bois d' Abies concolor contient plus de mannose et moins de xylose que le bois de Populus tremuloides (Kaar et al., 1991).

De nombreux couplages sont mis en place afin de mieux séparer les composés. Le couplage HPLC-SM permet d’accéder à la caractérisation de la fraction non volatile des produits naturels, qui peut comprendre les tritérpenoïdes, les flavonoïdes etc. L’HPLC permet un premier fractionnement, les constituants sont séparés par classe de composés avant l’introduction et l’identification par SM en limitant les coélutions. Ainsi, Laitinen et al. ont utilisé ce couplage et celui HPLC-PDA, pour l’identification de composés phénoliques et de tritérpenoïdes de clones de Betula pendula (Laitinen et al., 2004).