Dans les feuilles des végétaux, la quantité d’amidon présente dans les chloroplastes va suivre un cycle dépendant de la luminosité. Ainsi, celui-ci s’accumule durant la journée grâce à l’excès d’énergie produit via la photosynthèse et va être dégradé durant la nuit pour subvenir aux besoins de la plante qui poursuit sa croissance. L’importance de ce polysaccharide chez les végétaux fait qu’en l’absence de synthèse ou de dégradation, la plante sera affectée dans sa croissance. L’essentiel des études concernant le catabolisme du polysaccharide de réserve a longtemps porté sur le rôle des hydrolases mais, plus récemment, d’autres enzymes dont l’activité affecte les propriétés même du grain d’amidon, ont été caractérisées.
1. Solubilisation du grain
La principale difficulté rencontrée au cours de la dégradation de l’amidon réside dans son caractère semi-cristallin qui le rend inaccessible aux activités hydrolytiques. La première étape requise pour cette voie catabolique consiste donc en la solubilisation de ses chaînes externes de glucoses qui est rendue possible grâce à la phosphorylation de certains résidus. Cette modification de l’amidon est effectuée par des enzymes de type dikinase telle que l’α-glucan, water dikinase (Gwd) qui transfère le groupement phosphate en β d’une molécule d’ATP sur les résidus de glucose en position C6 principalement, le phosphate en γ étant lui libéré sous forme de phosphate inorganique (Figure 8 ; Ritte et al., 2002). Le rôle de cette protéine, désignée auparavant par le terme R1, a pu être découvert grâce à des travaux réalisés notamment chez Solanum tuberosum qui ont mis en évidence une diminution générale du taux de phosphate dans le grain d’amidon associée à un défaut de dégradation et donc à un phénotype sex (Starch EXcess) dans les feuilles (Lorberth et al., 1998). Gwd est capable de se lier de manière réversible au grain d’amidon via un domaine de liaison aux carbohydrates (Carbohydrate Binding Module, CBM ; Mikkelsen et al., 2006) et ceci d’une façon dépendante de l’état physiologique de la plante puisque l’association au grain est plus forte durant la nuit, période où la dégradation s’effectue (Ritte et al., 2000). Chez Arabidopsis thaliana, plusieurs lignées sex1 déficientes pour l’activité Gwd ont également été caractérisées et montrent le même phénotype que chez la pomme de terre, à savoir
une diminution du taux de phosphorylation du grain d’amidon qui s’approche de zéro pour certaines, associée à une augmentation de la quantité d’amidon accumulée tout au long du cycle et un niveau de dégradation très diminué voir aboli au cours de la nuit (Caspar et al., 1991 ; Yu et al., 2001). L’action de Gwd sur le grain d’amidon a le même effet qu’une solubilisation thermique et suffit in vitro à le rendre accessible aux activités hydrolytiques puisque l’activité β-amylase sur une molécule préalablement phosphorylée par Gwd est deux fois plus élevée que sur un grain « nu » (Edner et al., 2007) mais il semblerait qu’il en soit autrement in vivo.
En effet, une autre isoforme de Gwd, nommée phosphoglucan water dikinase (Pwd) intervient également au cours de ce processus de phosphorylation mais n’agit que sur des résidus préalablement phosphorylés en C6. Elle possède le même mode d’action que Gwd mais transfère le groupement phosphate en position C3 du résidu. L’existence et l’implication de cette deuxième dikinase a été mise en évidence par deux études simultanées effectuées chez Arabidopsis thaliana et qui ont montré que la lignée mutante est affectée dans sa dégradation (Baunsgaard et al., 2005 ; Kötting et al., 2005). En effet, la lignée pwd d’Arabidopsis présente une diminution de la phosphorylation des résidus de glucose en position C3 corrélée à un phénotype sex mais dans une moindre mesure que chez la plante gwd. Cette différence est probablement due au fait que la phosphorylation partielle par Gwd dans un premier temps est suffisante pour enclencher l’hydrolyse d’une partie de l’amidon. De plus, l’action de Pwd est également dépendante de l’état physiologique de la plante puisqu’elle se lie au grain d’amidon de préférence durant la nuit (Kötting et al., 2005).
Une troisième isoforme de Gwd a été identifiée chez Arabidopsis thaliana : AtGwd2. Elle possède le même mode d’action que Gwd1 in vitro mais n’est a priori pas impliquée dans le métabolisme de l’amidon puisque la lignée mutante gwd2 ne montre aucun phénotype amidon et cette protéine n’est pas adressée au chloroplaste (Glaring et al., 2007).
Gwd et Pwd vont donc agir de manière successive et phosphoryler les résidus de glucose en position C6 et C3, respectivement (Ritte et al., 2006). Cette phosphorylation perturbe l’organisation structurale de l’amylopectine et la rend accessible aux activités hydrolytiques comme les β-amylases qui sont incapables d’agir sur un substrat cristallin (Hejazi et al., 2008). Toutefois, une étude menée in
vitro a montré que les molécules de maltose libérées par les β-amylases sont exclusivement non-phosphorylées (Edner et al., 2007) et Takeda et Hizukuri en 1981 avaient déjà révélé l’incapacité de ces β-amylases à cliver un substrat phosphorylé. La digestion complète du grain nécessite donc l’intervention d’une activité supplémentaire de déphosphorylation.
Figure 8 : Spécificités de substrat des dikinases et des phospho-glucane phosphatases. Les
dikinases Gwd et Pwd sont capables de phosphoryler en position C6 et C3, respectivement. La phosphatase Sex4 peut déphosphoryler aux deux positions tandis que Lsf2 est C3-spécifique.
Cette activité est principalement représentée chez Arabidopsis thaliana par la protéine Sex4 qui est une phospho-glucane phosphatase muni d’un CBM qui lui permet de se lier à l’amidon (Kerk et al., 2006 ; Kötting et al., 2009). La lignée sex4 d’Arabidopsis présente évidemment un phénotype sex avec une accumulation de
petits glucanes phosphorylés. La protéine manquante était dans un premier temps prédite comme étant une protéine phosphatase à double spécificité (DSP : dual- specificity phosphatase ; Niittylä et al., 2006) mais des comparaisons de structure et de fonction ont ensuite permis de la relier à la laforine, une DSP capable de déphosphoryler des carbohydrates de structure complexe et notamment le glycogène chez l’homme (Worby et al., 2006 ; Gentry et al., 2007). Son absence conduit à une hyper-phosphorylation de la molécule associée à une dérégulation du branchement et induit la formation des particules de Lafora, forme insoluble de glycogène (Tagliabracci et al., 2007). Au niveau de l’individu, cela se traduit par une épilepsie chez l’enfant qui est fatale sous dix ans. La fonction de cette protéine a donc conduit à révéler le rôle de Sex4 dans la déphosphorylation des résidus de glucose préalablement phosphorylés par Gwd et Pwd (Kötting et al., 2009). Plus particulièrement, Sex4 est capable d’hydrolyser le groupement phosphate aux deux positions C6 et C3 mais montre une préférence pour la position C6 (Hejazi et al., 2010).
Deux autres gènes codant des DSPs similaires à Sex4 existent dans le génome d’Arabidopsis et il apparaît que c’est Lsf2 (Like SexFour 2) qui est la plus directement impliquée dans la dégradation de l’amidon. Comme Sex4, Lsf2 se lie au grain d’amidon malgré l’absence de CBM et va déphosphoryler spécifiquement en position C3 (Santelia et al., 2011). Par conséquent, l’amidon de la lignée lsf2 est fortement phosphorylé en C3 par rapport à la lignée sauvage, mais pas suffisamment pour induire un phénotype sex, ceci s’expliquant par la redondance fonctionnelle avec Sex4. Toutefois, l’absence conjointe de Sex4 et Lsf2 conduit à une aggravation du phénotype par rapport au simple mutant sex4. Une seconde phosphatase, Lsf1 est également impliquée dans le catabolisme de l’amidon comme le montre le phénotype sex observé chez la lignée mutante (Comparot-Moss et al., 2010) mais le taux de phosphorylation de l’amidon y est normal aux deux positions et aucune activité catalytique n’a pu être détectée à partir de l’enzyme recombinante. L’hypothèse formulée par les auteurs est que Lsf1 serait une protéine phosphatase comme la plupart des DSPs et qu’elle ciblerait des enzymes directement impliquées dans la dégradation, les activant ainsi par déphosphorylation.
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