Matériels et Méthodes
IV. Caractérisations biochimiques
1. Extraction et dosage de l’amidon
Un litre de culture de Chlamydomonas est centrifugé 10 min à 3000 rpm et 4°C. Le culot de cellules est repris dans 5 mL d’eau stérile et soniqué pendant 1 min sur glace. Le culot obtenu après une nouvelle centrifugation (4000 rpm, 15 min) est resuspendu dans 1,5 mL de Percoll 90 % pour en purifier l’amidon par gradient de densité. Celui-ci est culotté par centrifugation 10 min à 13200 rpm et lavé par 1,5 mL d’eau. La suspension obtenue est diluée pour avoir un aspect laiteux correspondant à une concentration en polysaccharide adéquate pour le protocole de dosage enzymatique.
L’amidon étant insoluble, ce dosage ne pourra se faire sans une étape préalable de solubilisation. Trois dilutions (1/5ème, 1/10ème et 1/20ème dans 30 µL) de
cette suspension sont bouillies 5 min à 99°C pour obtenir un empois d’amidon utilisable. Celui-ci est ensuite dosé à l’aide du kit Enzytec Starch Assay (R-Biopharm, Darmstadt, GER). Le principe de ce dosage repose sur la libération des molécules de glucose via l’action de l’amyloglucosidase. Ces glucoses sont ensuite convertis en G6P et en 6-phosphogluconate par une hexokinase et une glucose-6-phosphate déshydrogénase. La production de 6-phosphogluconolactone est couplée à la réduction d’une molécule de NADP, produisant ainsi du NADPH dont on mesure l’apparition au spectrophotomètre à 340 nm.
2. Dosage des polysaccharides solubles
Après sonication des cellules et centrifugation, le surnageant peut être utilisé pour doser la quantité de polysaccharides solubles. Dans ce cas, il sera d’abord bouilli 10 min à 99°C pour inactiver toute enzyme pouvant les dégrader. Un échantillon non dilué sera ensuite soumis au kit de dosage avec en parallèle un témoin sans amyloglucosidase qui permettra d’évaluer la part de glucose libre dans la totalité des polysaccharides.
3. Chromatographie de tamisage moléculaire (CL-2B)
La chromatographie de tamisage moléculaire a pour but de séparer les deux sous-fractions de l’amidon, l’amylopectine et l’amylose afin d’évaluer la part de chacune et de mettre en évidence une éventuelle altération structurale de l’amylopectine par variation de la longueur d’onde au maximum d’absorption (λmax).
Dans un premier temps, 2 mg d’amidon sont bouillis dans 100 µL de DMSO 100 % pendant 10 min à 99°C avant d’être précipités par 900 µL d’éthanol et conservés à -20°C. L’échantillon est ensuite centrifugé (13200 rpm, 10 min), le culot est resuspendu dans 300 µL de soude 10 mM (NaOH) puis déposé sur une colonne de sépharose CL-2B de 8 mm de diamètre et 70 cm de hauteur. L’élution se fait par la soude à un débit de 11 à 12 mL/h. Cent fractions de 300 µL sont recueillies et la λmax est mesurée au spectrophotomètre pour chacune (80 µL de fraction + 20 µL de
solution d’iode). La solution d’iode se compose de 10 g d’iodure de potassium (KI) pour 1 g de diiode (I2) par litre.
L’analyse au spectrophotométre de chaque fraction permet de déterminer lesquelles contiennent l’amylopectine ou l’amylose. Les fractions peuvent ensuite être poolées en deux fractions principales contenant les deux types de polysaccharide. Le pourcentage d’amylose peut alors être évalué par dosage du glucose contenu dans les deux fractions.
4. Distribution en longueur de chaînes (CLD) de
l’amylopectine
Suite à la chromatographie de tamisage moléculaire, l’amylopectine peut être récupérée pour en analyser le profil CLD. Elle est d’abord dialysée pour éliminer la soude puis lyophilisée. Après resuspension dans 1 mL de tampon acétate de sodium 55 mM pH 3.5, elle est incubée en présence de 6 unités d’isoamylase et 3 unités de pullulanase une nuit à 42°C pour permettre l’hydrolyse de la totalité des points de branchement.
Les glucanes linéaires obtenus sont purifiés sur une colonne de charbon graphité, lyophilisés une deuxième fois puis analysés sur une colonne de chromatographie échangeuse d’anion haute performance à détection
ampérométrique pulsée (HPAEC PAD). L’élution est réalisée dans la soude 150 mM à l’aide d’un gradient de 0 à 400mM d’acétate de sodium en 49 minutes.
5. Dosage du NAD(P)/NAD(P)H
Des cellules de Chlamydomonas en phase exponentielle de croissance (15-20 µg de chlorophylle par mL) sont culottées et congelées à -80°C. Pour chaque métabolite, un volume différent aura été prélevé, à savoir : 2,5 mL pour le NAD, 10 mL pour le NADH, 5 mL pour le NADP et 14 mL pour le NADPH. Ensuite, le protocole diffère selon que l’on veut analyser la forme réduite ou oxydée.
Pour les formes oxydées NAD+/NADP+, le culot est resuspendu dans 300 µL de milieu TAP. 250 µL d’acide chlorhydrique 0,1 M sont ajoutés et le mélange est bouilli 2 min à 100°C. L’ensemble est neutralisé par 250 µL de soude 0,1 M puis refroidi sur glace avant d’être centrifugé 1 min à 7000 rpm. Le surnageant est alors utilisé pour le dosage en lui-même. Pour les formes réduites NADH/NADPH, le culot est d’abord resuspendu dans 250 µL de TAP, l’extraction est effectuée par 250 µL de soude 0,1 M et la neutralisation à l’aide d’acide chlorhydrique 0,1 M.
Lors du dosage du couple NAD+/NADH, un mélange est réalisé. Celui-ci contient 152 µL du surnageant extrait, 30 µL de tampon Bicine 1 M, 30 µL d’EDTA 40 mM, 30 µL de bromure de 3-(4,5-diméthylthiazolyl-2)-2,5-diphényltetrazolium (MTT) 4,2 mM, 30 µL de phénazine éthosulfate (PES) 16,6 mM et 30 µL d’éthanol absolu. L’ensemble est porté à 37°C par incubation pendant 5 min puis 6,4 µL d’alcool déshydrogénase (500 U/mL) sont ajoutés avant de suivre l’évolution de l’absorbance à 570 nm pendant 10 min. Le NAD+ est converti en NADH par l’action de l’alcool déshydrogénase puis celui-ci réduit, via le PES, le MTT qui absorbe à 570 nm. Ce système permet un renouvellement permanent du NADH, ainsi la vitesse de réduction du MTT sera constante sur un intervalle supérieur à 10 min et est proportionnelle à la concentration du coenzyme.
Pour le couple NADP+/NADPH, le principe est le même sauf que l’enzyme utilisée est la glucose-6-phosphate déshydrogénase (5 µL à 500 U/mL) et le substrat le G6P 50 mM. Des courbes étalons ont été réalisées à l’aide de solutions à 100 µM, 200 µM, 400 µM et 600 µM de NADH et 25 µM, 50 µM, 100 µM et 200 µM pour les autres coenzymes d’oxydo-réduction.
6. Dosage de la chlorophylle
La quantité de chlorophylle dans un échantillon est évaluée par la mesure de l’absorbance au maximum d’absorption de chaque forme de chlorophylle, la chlorophylle a à 663 nm et la chlorophylle b à 646 nm.
Un millilitre de culture est culotté à 3000 rpm pendant 5 min puis resuspendu dans 1 mL de mélange Acétone / Méthanol (80:20). L’absorbance du surnageant obtenu après une nouvelle centrifugation (13000 rpm, 5 min) est mesurée à 750 nm, 663 nm et 646 nm. L’absorbance à 750 nm est soustraite aux autres et la concentration en chlorophylle (mg/mL) est calculée selon la formule :