Construction de la banque de mutants

1. Préparation de l’autolysine

L’autolysine est l’enzyme produite par Chlamydomonas reinhardtii dans le but de dégrader la paroi d’un partenaire sexuel de polarité opposée. Sa préparation passe donc automatiquement par la mise en présence de deux souches distinctes, l’une de polarité mt+, l’autre mt-. Dans un premier temps, les deux souches 137C (mt-) et CC125 (mt+) sont incubées séparément en milieu TAP-N pendant une nuit afin d’induire la gamétogenèse. Elles sont ensuite mises en présence l’une de l’autre pour induire la production de l’enzyme mais à l’obscurité, ce qui empêche la fusion des cellules et maximise le rendement en autolysine. L’incubation dure deux heures puis l’autolysine secrétée dans le milieu est isolée des cellules par centrifugation 10 minutes à 4000 rpm puis stérilisation sur filtre 0,22 µm avant d’être stockée à -80°C.

2. Test de l’autolysine

Pour évaluer la qualité de l’autolysine produite, sa capacité à dégrader la paroi cellulaire est testée sur la souche sauvage 137C. 1 mL d’autolysine est ajouté à 100µL d’une suspension dense de cellules. Un témoin est réalisé parallèlement pour lequel l’autolysine est remplacée par de l’eau. Les mélanges sont ensuite incubés une heure à 22°C et à la lumière. Après cette incubation, l’intégrité de la paroi est vérifiée par traitement des cellules au Triton X-100 0,1 %. Les cellules sont d’abord culottées par centrifugation 3 minutes à 3000 rpm afin d’éliminer le milieu et resuspendues dans 300 µL de Triton X-100 0,1 %. Le Triton X-100 induit la lyse des cellules dépourvues de paroi. Ainsi, la suspension soumise à l’autolysine doit lyser et après centrifugation, on observe un culot blanc composé de débris cellulaires et un surnageant de couleur verte due à la présence de chlorophylle. Parallèlement, le tube témoin doit avoir un culot vert composé de cellules saines et un surnageant translucide. Si le test n’est pas concluant, la préparation d’autolysine n’est pas utilisable et ne sera pas utilisée pour une transformation d’algues.

3. Amplification de la cassette

La cassette de résistance à la paromomycine (gène APHVII : aminoglycoside 3’-phosphotransférase de Streptomyces rimosus ; Sizova et al., 2001) est préparée par PCR sur le plasmide pSL18 (Figure 18). Les amorces ParoFor (5’- ACCATGATTACGCCAAGCGCGCAA-3’) et ParoRev (5’- CTCGACATGCGTTCACTTCCTGTC-3’) sont utilisées dans un cycle répété 30 fois comprenant une hybridation des amorces à 55°C et une polymérisation de 2 min pour permettre l’amplification d’un fragment de 1920 pb. Le produit de PCR est vérifié sur gel d’agarose 1 %, purifié et concentré à 100 ng/µL avant utilisation.

Figure 18 : Carte du vecteur de transformation pSL18. Celui-ci contient une origine de réplication et

un gène de résistance à l’ampicilline pour son amplification dans les bactéries ; la cassette de résistance à la paromomycine ainsi que les parties promotrice et terminatrice du gène PSAD. En bleu est indiqué le site de linéarisation du plasmide par EcoRI. En rose figurent les sites d’hybridation des amorces utilisées pour l’amplification de la cassette, la PCR inverse, la TAIL-PCR et le séquençage.

4. Préparation du plasmide

Le plasmide pSL18 vide est amplifié par transformation puis culture de bactéries compétentes Top10 en milieu LB + ampicilline (50 µg/mL). Les bactéries sont ensuite culottées par centrifugation et le plasmide est purifié à l’aide du kit Nucleospin Plasmid Easypure (Macherey-Nagel, Düren, Allemagne). Avant transformation, pSL18 est linéarisé par digestion à l’aide de l’enzyme de restriction EcoRI (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA).

5. Transformation de Chlamydomonas

Préparation de la souche

Dans un premier temps, la souche sauvage est cultivée durant 5 à 7 jours dans 50 à 200 mL de milieu TAP+N. Arrivées en fin de phase exponentielle, les cellules sont centrifugées à 3000 rpm pendant 10 minutes puis incubées pendant 2 heures dans 20 mL d’autolysine à la lumière pour permettre la dégradation de la paroi. Pour la transformation, deux techniques ont été utilisées : la méthode des billes de verre (Kindle, 1990) et l’électroporation.

Méthode des billes de verre

Les cellules sans paroi sont centrifugées (3000 rpm, 5 min) et resuspendues dans 5 mL de TAP+N. 300 µL de cette suspension sont transférés dans un tube stérile contenant 250 mg de billes de verre (diamètre 400 µm). 500 ng de plasmide linéarisé y sont ajoutés et le mélange est vortexé pendant 10 sec pour permettre l’entrée du vecteur dans les cellules. 600 µL de TAP+N sont finalement ajoutés et l’ensemble est étalé sur un milieu HSA riche contenant de la paromomycine (10 µg/mL).

Electroporation

Les cellules sont centrifugées (3000 rpm, 5 min) et resuspendues dans du milieu TAP+N contenant 40 mM de saccharose (stérilisé par filtration sur un filtre 0,2 µm). 250 µL de suspension sont incubés sur glace durant 10 min en présence de 100 ng de cassette de résistance dans une cuvette d’électroporation d’intervalle 4 mm. Un choc électrique exponentiel (voltage 800 V, capacitance 25 µF) est appliqué au mélange sur un système Gene Pulser Xcell™ de Biorad (Richmond, CA, USA). 10 mL de TAP+N sont ajoutés et les cellules sont incubées 18 h en lumière atténuée avant d’être étalées sur milieu HSA riche + paromomycine.

Des colonies isolées apparaissent en 7 à 10 jours. Celles-ci sont repiquées et amplifiées sur milieu HSA riche + paromomycine avant d’être soumis au crible à l’iode en deux étapes.

6. Crible des transformants

Une fois que la quantité de cellules est suffisante (sous 5 à 7 jours), L’ensemble des transformants repiqués ainsi que la référence sauvage 137C sont mis en suspension dans du milieu TAP-N sur une plaque de microtitration 96 puits stérile. 15 µL de ces suspensions sont déposés de manière ordonnée sur deux boîtes de Pétri contenant du milieu gélosé TAP-N. Ces patches cellulaires sont ensuite placés 5 jours sous lumière vive, temps nécessaire à l’obtention d’une accumulation massive d’amidon. Au terme de cette période, la carence azotée est levée sur l’une des deux boîtes par ajout de 15 µL d’une solution de chlorure d’ammonium (NH4Cl) à 150 mM sur chaque patch. Celle-ci est ensuite incubée à

l’obscurité dans du papier aluminium pendant 24 h pour permettre la dégradation du polysaccharide. Finalement, la boîte où la carence aura donc été maintenue 6 jours, et la boîte incubée à l’obscurité sont soumises aux vapeurs de diiode. Sur la première boîte, la majorité des patches se colorent en bleu-nuit comme la souche sauvage, signe d’une synthèse normale de l’amidon tandis que sur la seconde, cette coloration due à l’interaction iode/polysaccharide sera en principe perdue et les patches présentent alors une couleur verdâtre.

La première boîte que l’on peut désigner « de synthèse » permet l’identification de souches déficientes pour la biosynthèse du polysaccharide et qui présenteront soit une couleur différente de la référence sauvage (rouge, verdâtre, marron), soit une absence de coloration. Sur la seconde boîte, « de dégradation », les patches n’ayant pas perdu l’interaction iode/polysaccharide seront désignés comme candidats mutants de dégradation. Ceux-ci ne sont que des candidats puisque le crible sur milieu gélosé ne permet pas de distinguer un mutant de dégradation qui conserve le pool d’amidon accumulé, d’un mutant surproducteur qui est capable de dégrader son amidon mais pas en quantité suffisante pour perdre l’interaction à l’iode après 24 h.

L’ensemble des candidats obtenus par ce premier crible est repiqué sur milieu HSA riche puis soumis une seconde fois au crible à l’iode. Si le résultat est confirmé, l’analyse du phénotype se poursuit en milieu liquide, notamment pour écarter les mutants surproducteurs.