CBA (Cytometric Beads Array)

Cette technique a été utilisée pour doser le TNF-α et le GrB

Principe

La technique CBA permet de doser simultanément plusieurs analytes (cytokines (dans notre cas), chémokines, protéines du complément…), dans un volume minimal d’un même échantillon biologique (surnageant de culture (dans notre cas), sérum, plasma, …).

Elle se base sur l’utilisation de billes en polystyrène colorées par un fluorophore rouge, l’Allophycocyanine (APC), qui sont coatées par des anticorps spécifiques pouvant capturer les cytokines à doser. Chaque population de billes est spécifique d’une cytokine déterminée et possède une intensité de fluorescence unique, permettant de la distinguer des autres populations (Figure 16). Ainsi, différentes populations de billes possédant des intensités de fluorescence différentes peuvent être combinées pour détecter plusieurs cytokines à la fois (test de multiplexage).

La cytokine capturée est détectée par l'addition d'un anticorps de détection fluorescent couplé à la phycoérythrine (PE) (la longueur d'onde d'émission du PE se distingue de celle des billes de capture (APC)). Grâce à une analyse par cytométrie en flux, les taux de cytokines capturées par les différents groupes de billes sont déterminés en analysant le signal du PE, qui est proportionnel à la quantité de cytokine présente dans l’échantillon. Les concentrations des cytokines sont calculées en traçant des courbes standard à partir d’une dilution en série d’un mélange des cytokines standard, de concentration connue.

Méthodologie

Des kits BD CBA Human Flex set (BD Biosciences) ont été utilisés pour doser le TNF-α et le GrB. Chaque kit spécifique d’une cytokine, contient les billes coatées par l’anticorps de capture spécifique, l’anticorps de détection PE spécifique et 2 fioles de la cytokine standard, lyophilisée. Le kit BD CBA Human Soluble Protein Master Buffer Kit (BD Biosciences), contenant « Assay diluent, capture bead diluent, capture bead diluent for serum/plasma samples, detection reagent diluent, wash buffer, instrument setup reagents », a aussi été utilisé.

1/ Préparation du mix des standards (TNF-α et GrB)

Les standards (TNF-a et GrB) ont été lyophilisés et reconstitués le jour même de l’expérience dans le tampon « Assay Diluent ». Les standards ont été mélangés dans un même tube dans lequel 2 mL du tampon « Assay diluent » ont été rajoutés. Ce tube a été placé pendant 15 minutes sur la paillasse afin de stabiliser la solution. A partir de ce tube (noté Top standard), une dilution en série (dilution au ½) a été réalisée dans le tampon « Diluent Assay » pour avoir une gamme standard de 10 concentrations allant de 5000 pg/ml à 9,76 pg/ml (Tableau 16).

Tableau 16. Différentes concentrations de la gamme standard de chaque cytokine

2/ Préparation du mix des billes de capture de TNF-α et du GrB

Les billes de capture spécifiques du TNF-α et du GrB ont été mélangées dans un tube (noté Mix Capture Beads) (1µl de chaque bille/test) et diluées dans le « Capture Bead Diluent ». Le nombre de tests incluant le nombre d’échantillons à tester, chacune des dilutions des standards et le contrôle négatif (surnageant de culture de cellules non stimulées), a été déterminé.

Par exemple pour un échantillon de surnageant de culture (un test), il faut mélanger : · 1µl de billes anti-TNF-α

· 1µl de billes anti-GrB

Compléter à 50 µl (2µl Mix de Billes de capture + 48µl Capture Bead Diluent)

Par exemple, pour une expérience incluant 86 échantillons (surnageants de culture à tester), 10 dilutions de standards et un contrôle négatif, nous avons prévu un mix de billes de capture pour 100 tests (1 µl de chaque bille de capture x 100 (100 µl par bille de capture), qsp 50 µl x 100 soit 5 ml).

3/ Préparation du Mix Reactifs Detection PE

Les anticorps de détection spécifiques de TNF-α et de GrB couplés au PE ont été mélangés (1µl d’anticorps de détection/test) et dilués dans le tampon « Detection Reagent Diluent » (tube noté Mix Detection).

Pour 1 test (50µl): 2µl Mix d’anticorps de détection couplé au PE + 48µl Detection Reagent Diluent.

4/ Procédure du test CBA Human Flex Set

50 µl de billes de captures ont été prélevés à parti du tube Mix Capture Beads préalablement vortexé et distribués dans les tubes test (tubes pour FACS). Les surnageants de culture à analyser et les différentes dilutions de la gamme standard, ont été rajoutés dans les tubes test correspondants, à raison de 50 µl/tube. Les tubes ont été incubés à l’obscurité pendant 1 heure à température ambiante. 50µl d’anticorps de détection prélevés à partir du tube Mix Detection, ont été rajoutés à chacun des tubes test et incubés à l’obscurité pendant 2 heures à température ambiante.

Après un lavage avec du « Wash Buffer », les tubes ont été centrifugés à 200g pendant 5 min et les surnageants ont été éliminés par aspiration. 300µl de tampon de lavage ont été rajoutés pour resuspendre le culot de billes. Les tubes ont été conservés à l’obscurité et analysés le même jour par FACS (FACS Canto II).

5/ Préparation des tubes CBA Flex set control pour le réglage du FACS Cette étape de réglage du FACS a dû être réalisée pour chaque expérience CBA.

Des billes annotées A9, PE-F1, F1, F9 et A1, fournies dans le kit BD CBA Human Soluble Protein Master Buffer Kit, ont été utilisées pour les réglages des voltages FSC-SSC (taille/structure), des fluorochromes (APC, APC-Cy7 et PE) et des compensations automatiques. Ces réglages permettent de paramétrer le cytomètre à flux pour la taille de la population de billes (FSC-SSC) et pour les fluorescences utilisées (Figure 17).

200 µl de wash buffer ont été rajoutés dans chacun des tubes A9, PE-F1, F1, F9 et A1, et 25µl de chaque bille setup control ont été rajoutés dans les tubes correspondants.

6/ Expression et analyse des résultats

Les résultats ont été exprimés en pg/ml et déterminés à partir des courbes standard. L’analyse des résultats a été faite à l’aide du logiciel FCAP (FCAP Array; BD Biosciences).

Figure 17. Acquisition des données du test CBA par un cytométre a flux A Dot Plot SSC versus FSC utilisé pour localiser la position des billes de cytokine .B. Hiérarchie de populations des billes. C représentation biparamétrique APC-Cy7/PE des différentes populations de billes analysées : Les nuages de points de haut en bas représentent respectivement le TNF-α et le GrB (cultures non stimulées). D Avec une concentration élevée des cytokines, les nuages de points se déplacent vers la droite. L'intensité de la fluorescence PE est corrélée à la concentration de cytokines testées (cultures stimulées par PHA)

II.2.4. ELISPOT (Enzyme-Linked Immunosorbent SPOT assay)