Caractérisation des populations lymphocytaires T CD4+ et T CD8+

II.4.1.1. Fréquence des LT CD4+ productrices d’IFN-γ et de GrB

Les cellules T ont été identifiées, au sein de la population des lymphocytes totaux, par l’expression du marqueur CD3. Les T CD4+ ont été distingués au sein de la population LT par l’expression des marqueurs CD3 et CD4. Parmi la population T CD4+, nous avons identifié les cellules spécifiques sécrétrices d’IFN-γ ou de GrB (Figure 34).

Figure 34. Analyse par cytométrie en flux, des cellules T CD4+ sécrétrices d’IFN-γ ou de GrB, après stimulation par la PMA/Iono et le P21, chez un

individu guéris de LCZ (Expérience représentative)

Comme le montrent le tableau 30 et la figure 35, la stimulation par le SLA s’est accompagnée d’une augmentation significative des pourcentages des populations T CD4+ productrices d’IFN-γ et CD4+ productrices de GrB.

Nous avons observé des augmentations significatives des pourcentages des cellules T CD4+ productrices d’IFN-γ en réponse à tous les pools de peptides, P8 (Médiane±IQR NS vs Stim : 0,28±0,74 vs 0,79±1,9), P9 (0,39±0,6 vs 1,62±2,5), P13 (0,17±0,62 vs 4,21±6,10), P14 (0,22±0,78 vs 1,11±1,13), P16 (1,08±1,3 vs 3,06±4,11) et P21 (0,17±0,6 vs 1,26±3,12)

(Tableau 30, Figure 35 A) (p≤0,0092). Une augmentation des pourcentages des cellules T CD4+ productrices de GrB a aussi été observée en réponse aux pools P8 (1,47±3,68 vs 4,27±12,09), P9 (1,47±3,68 vs 3,71±6,14), P16 (1,47±3,68 vs 4,15±11,22) et P21 (1,47±3,68 vs 6,4±12,10) (p≤0.03) (Tableau 30, Figure 35 B).

Nous avons également évalué le pourcentage de la population T CD4+ sécrétrices d’IFN-γ et de GrB parmi les T CD4+ totaux. Une augmentation significative de cette population a été observée après stimulation par le P21 (1,7 / 3,1; 0,1 / 0,5) (p = 0,01). Aucune corrélation n'a été observée entre les cellules T CD4+ IFN-γ+ et les cellules T CD4+ GrB +.

Tableau 30. Pourcentages des LT CD4+ producteurs d’IFN-γ et de LT CD4+ producteurs de GrB, en réponse à une stimulation par les pools de peptides P8,

P9, P13, P14, P16 et P21, chez des individus guéris de LCZ

Figure 35. Pourcentages des populations LT CD4+ producteurs d’IFN-γ et de LT CD4+ producteurs GrB, après stimulation par les pools P8, P9, P13, P14, P16 et

P21, chez des individus guéris de LCZ (Cytométrie en flux)

Les PBMC issus d’individus guéris de LCZ, préalablement stimulés par les pools de peptides sélectionnés (1 µM/peptide) pendant 10 jours, ont été restimulés par les mêmes pools de peptides (1 µM / peptide) en présence des anticorps de costimulation anti-CD49d / anti-CD28 (1 μg/ml). Pour la détection intracellulaire d'IFN-γ (n = 21) et de GrB (n = 9), les cellules ont été traitées avec du Golgistop pendant 6 h de culture, fixées et perméabilisées. Les résultats représentent les pourcentages des populations de cellules T CD4+IFN-γ+ (A) et CD4+GrB+ (B). Les barres horizontales représentent les valeurs des médianes. La significativité statistique a été attribuée à une valeur de p <0,05 (* p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001).

II.4.1.2. Fréquence des LT CD8+ productrices d’IFN-γ

Nous avons évalué la production d’IFN-γ par les cellules T CD8+ spécifiques des pools de peptides sélectionnés, chez des individus guéris de LCZ. Comme le montrent le tableau 31 et

la figure 36, la stimulation par la PMA/Iono et par le SLA s’est accompagnée d’une

augmentation significative des pourcentages des populations T CD8+ productrices d’IFN-γ.

Nous avons observé une augmentation significative des pourcentages des cellules T CD8+ productrices d’IFN-γ en réponse aux pools de peptides P8 (Médiane des % de cellules±IQR NS vs Stim: 2.01±1.48 vs 2.54±2.69), P9 (2.01±1.48 vs 2.66±2.86), P13 (2.18±0.94 vs 6.13±3.83), P16 (2.01±1.48 vs 3.32±4.85) et P21 (2.01±1.48 vs 4.6±7.07), (p≤0.03).

Tableau 31. Pourcentages des LT CD8+ producteurs d’IFN-γ en réponse à une stimulation par les pools de peptides, P8, P9, P13, P14, P16 et P21, chez des

Figure 36. Pourcentages des populations LT CD8+ productrices d’IFN-γ, après stimulation par les pools P8, P9, P13, P14, P16 et P21, chez des individus guéris

de LCZ (Cytométrie en flux)

Les PBMC issus d’individus guéris de LCZ (n = 9), préalablement stimulés par les pools de peptides sélectionnés (1 µM / peptide) pendant 10 jours, ont été restimulés par les mêmes pools de peptides (1 µM / peptide) en présence des anticorps de costimulation anti-CD49d/anti-CD28. Pour la détection intracellulaire d'IFN-γ, les cellules ont été traitées avec le Golgistop pendant 6 h de culture, fixées et perméabilisées Les barres horizontales représentent les valeurs des médianes des pourcentages de TC8+ IFN-γ +. La significativité statistique a été attribuée à une valeur de p <0,05 (* p <0,05, ** p <0,01).

II.4.1.3. Caractérisation de la réponse lymphocytaire T CD4+ polyfonctionnelle Il a été démontré que la qualité de la réponse immunitaire, définie par la production simultanée de l’IFN-γ, du TNF-α et de l’IL-2 par les LT CD4+, pourrait constituer un corrélat de protection contre l’infection par Leishmania (Darrah et al., 2007).

Afin d’évaluer l’activation de cette population de LT polyfonctionnels, par les pools de peptides, nous avons effectué un marquage membranaire (CD3, CD4) et intracellulaire (IFN- γ, TNF-α et IL-2) des PBMCs issus d’individus guéris, après stimulation par la PMA/Iono, le SLA ou les pools de peptides P8, P9, P13, P14, P16 et P21.

Les cellules T ont été identifiées, au sein des lymphocytes totaux, par l’expression du marqueur CD3 et les cellules T CD4+ ont été identifiées au sein de la population T, par l’expression des marqueurs CD3 et CD4. Nous avons commencé par identifier les cellules sécrétrices d’une seule cytokine (IFN-γ, IL-2 ou TNF-α), parmi la population T CD4+

(Figure 37). Pour l’identification des T CD4+ monofonctionelles (productrices d’une seule cytokine), bifonctionnelles (productrices de deux cytokines) ou polyfonctionnelles (productrices de trois cytokines), nous avons utilisés la méthode de « boolean gating », stratégie permettant la sélection des populations de cellules sur la base de la logique «ET» et

«NON». Cela nous permet d’identifier des populations de cellules produisant les cytokines ‘a’ et ‘b’, mais pas ‘c’ et ainsi de suite.

7 populations cellulaires distinctes productrices de cytokines ont été déterminées, 3 cytokines : IFN-γ+IL-2+TNF-α+ ; 2 cytokines : IFN-γ+IL-2-TNF-α+, IFN-γ-IL-2+TNF-α+, IFN-γ-IL- 2+TNF-α+ ; 1 cytokine : IFN-γ+IL-2-TNF-α-, IFN-γ-IL-2+TNF-α-, IFN-γ-IL-2-TNF-α+)

(Figure 37).

Figure 37. Caractérisation de la polyfonctionnalité des populations LT CD4+ par cytométrie en flux

La stimulation par la PMA a induit une augmentation significative des pourcentages des cellules T CD4+ polyfonctionnelles sécrétrices d’IFN-γ, d’IL-2 et de TNF-α, (Tableau 32, Figure 38). Cependant la stimulation par le SLA et les pools de peptides n’a pas induit une augmentation de cette population chez les individus guéris.

Une augmentation significative des pourcentages des cellules T bifonctionnelles (IFN- γ+TNF-α+ et IL-2+TNF-α +) et monofonctionnelles (IFN-γ+ et TNF-α+), a été détectée en réponse aux pools de peptides P13, P14 et P21 (p<0.04) (Tableau 32, Figure 38).

La stimulation par le P9 a induit une augmentation significative des pourcentages de cellules T CD4+ bifonctionnelles IFN-γ+/TNF-α+ et monofonctionnelles IFN-γ+ et TNF-α+ (Figure 38). Cependant, nous n'avons détecté aucun changement dans les pourcentages de ces populations en réponse au P16, probablement en raison du faible nombre d'individus analysés. P21 était le seul pool à induire une augmentation significative de la population LT CD4+ sécrétrice d’IL2.

Tableau 32. Pourcentages des LT CD4+ polyfonctionnels, en réponse à une stimulation par les pools de peptides P9, P13, P14 et P21, chez des individus

guéris de LCZ

Nb d'individus NS±IQR Stim±IQR Valeur de p Nb d'individus NS±IQR Stim±IQR Valeur de p Nb d'individus NS±IQR Stim±IQR Valeur de p

IFN-g+ TNF-a+ IL-2+ 0±0 0,866±1,8347 0,0009

IFN-g+ TNF-a+ IL-2- 0,0155±0,0685 1,139±1,64 0,0001 0,023±0,09325 0,0535±0,2755 0,02 0,049±0,07 0,293±0,806 0,03 IFN-g+ TNF-a- IL-2+ 0±0 2,09±4,3712 0,0001

IFN-g-TNF-a+IL-2+ 0±0 1,305±2,7722 0,0004 0±0 0,0145±0,1333 0,002

IFN-g+ TNF-a- IL-2- 0,034±0,4755 4,23±10,247 0,0003 0,0615±0,8735 0,4085±2,935 0,0001 0,074±0,198 1,12±1,18 0,04 IFN-g- TNF-a+ IL-2- 0,128±0,15675 1,116±1,367 0,0001 0,1575±0,251 0,3955±1,408 0,01 0,148±0,234 3,54±5,854 0,01 IFN-g+ TNF-a- IL-2+ 0,039±0,0725 3,66±14,3585 0,0001

Nb d'individus NS±IQR Stim±IQR Valeur de p Nb d'individus NS±IQR Stim±IQR Valeur de p Nb d'individus NS±IQR Stim±IQR Valeur de p

IFN-g+ TNF-a+ IL-2+

IFN-g+ TNF-a+ IL-2- 0±0,049 0,338±0,718 0,0017 0±0,03175 0,0885±0,1103 0,02 0±0,049 0,395±0,585 0,0001 IFN-g+ TNF-a- IL-2+

IFN-g-TNF-a+IL-2+ 0±0 0,063±0,342 0,0039 0±0 0,0825±0,2248 0,02 0±0 0,168±0,259 0,0002 IFN-g+ TNF-a- IL-2- 0±0,074 0,148±0,566 0,0005 0±0 0,0825±0,2543 0,02 0±0,074 0,16±0,304 0,0001 IFN-g- TNF-a+ IL-2- 0,122±0,148 0,841±1,189 0,0004 0,0445±0,1073 0,1615±0,4018 0,04 0,122±0,148 0,641±3,625 < 0,0001

IFN-g+ TNF-a- IL-2+ 0,041±0,074 0,101±0,177 0,0419

Phé notype de s TCD4+ Phé notype de s TCD4+ 15 8 15 PMA SLA P9 P13 P14 P21 20 20 7

Figure 38. Pourcentages des LT CD4+ polyfonctionnels, après stimulation par les pools P8, P9, P13, P14, P16 et P21, chez des individus guéris de LCZ

(cytométrie en flux)

Les PBMC issus d’individus guéris de LC (5 à 15 individus), préalablement stimulés par les pools de peptides sélectionnés (1 µM / peptide) pendant 10 jours, ont été re-stimulées pendant une nuit avec les mêmes pools de peptides (1 µM / peptide) en présence des anticorps de costimulation anti-CD49d /anti-CD28 (1 µg / ml). Pour la détection intracellulaire des cytokines, les cellules ont été traitées avec du Golgistop pendant 6 h de culture, fixées et perméabilisées. Les données ont été analysées par le logiciel FlowJo. La méthode « Boolean gating » a été utilisée pour identifier les cellules monofonctionnelles, bifonctionnelles et multifonctionnelles. La fréquence des cellules T CD4+ exprimant chacune des sept combinaisons possibles d'IFN-γ, d'IL-2 et de TNF-α, a été déterminée. Les barres horizontales représentent les valeurs médianes. La significativité statistique a été attribuée à une valeur de p <0,05 (* p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001).

II.4.2. Caractérisation de la réponse T mémoire centrale (TCM) et T mémoire