HKI HKII VDAC1 S0D2 * 120i (A ■S 1001 c n _ 801 «2? ■Contrôle ■CTZ H4ev shK8b 57
Figure 13. Le CTZ permet la libération du cyt c dans le cytoplasme des shK8b lors d'un stress oxydant, (a) Suivant la pré-incubation des cellules au CTZ, il y a libération cytoplasmique de cyt c chez les shK8b et les H4ev lors d'un traitement de 30 min avec 1 mM de H2O2, tel que démontré par immunobuvardage, alors que cette libération n'est observable que chez les H4ev lorsque le même traitement est effectué sans qu'il n'y ait pré- incubation au CTZ. (b) Le même phénomène est observé en immunofluorescence, alors qu'il y a une libération cytoplasmique de cyt c chez les shK8b et les H4ev après une pré- incubation de 1 h avec 15 pM de CTZ et un traitement de 30 min avec 1 mM de H2O2, libération qui n'est observée que chez les H4ev suivant le même traitement en absence de pré-incubation au CTZ.
a H*ev ahKlb CTZ C H C H C H C H CTZ Cytc u * . m . „ _ •1 SOO-2 g K. 1 - - | Control» CTZ(15uM| H4av «hK8b Contrôla CTZ{15uM) 59
Discussion
Les résultats rapportés ici démontrent que la mort des cellules hépatocytaires en réponse à un excès de ROS est dépendante de la mitochondrie et que, en absence de K8/K18, l'augmentation des niveaux de HK à la mitochondrie favorise la résistance des cellules à cette mort cellulaire. Lorsqu'il y a détachement de HKI de la mitochondrie, la résistance des cellules sans K8/K18 diminue à un niveau se rapprochant de celui des cellules hépatocytaires possédant les K8/K18. Ces résultats supportent les résultats précédemment publiés qui montrent une perturbation de la signalisation des PKC en surface de la mitochondrie en absence de kératine lors du stress oxydant [61].
L'association HK-mitochondrie et la perte des K8/K18
Comme mentionné précédemment, l'association de HKI et HKII à la OMM se fait par l'intermédiaire de leur liaison avec VDAC, en particulier VDAC-1, l'isoforme la plus abondante. Le domaine N-terminal de HKI et HKII est composé d'une séquence de 15 acides aminés qui forment une hélice-a capable de s'insérer dans la membrane mitochondriale et d'interagir avec un ou plusieurs domaines transmembranaires de VDAC-
1. Ce domaine N-terminal n'est pas présent chez les HKIII et HKIV, d'où leur incapacité à se lier à la mitochondrie. L'interaction de HKI et HKII est influencée par différents facteurs, entre autres l'état de phosphorylation de VDAC et la concentration intracellulaire de G6P [77]. L'état de phosphorylation de VDAC est modifié par certaines kinases, dont Akt, GSK-3P, PKCe [73,77] et potentiellement PKCô [70]. Bien que les résultats obtenus ne permettent pas d'infirmer l'implication de ces protéines dans la différence de liaison de HK à la mitochondrie en présence ou en absence de K8, il semble moins probable que ces protéines jouent un rôle prédominant dans le processus observé.
Comme il a été démontré récemment par le laboratoire, le métabolisme cellulaire est grandement perturbé en absence de K8/K18 [124]. En effet, des augmentations importantes de production de G6P et de glycogène ont été observées chez les hépatocytes et les hépatomes dépourvus de kératine. De plus, l'absence de kératines entraîne une augmentation des quantités totales et mitochondriales de HKI et de HKII autant chez les hépatocytes que chez les cellules d'hépatome. Sachant que l'association des HK I/II avec les mitochondries est étroitement liée à leurs rôles métaboliques et que l'absence de
kératine affecte cette association, il y a lieu de se demander si les K8/K18 affectent directement le niveau d'expression des HK ou leur capacité à se lier à la mitochondrie, ou les deux. Il a été démontré, entre autres par le laboratoire, que la perte de K8/K18 affecte la structure des mitochondries, en plus d'affecter la signalisation intracellulaire.
Il est difficile d'expliquer ce qui amène les cellules sans K8/K18 à présenter des quantités plus importantes de HK en surface de la mitochondrie. En considérant que ces cellules présentent un métabolisme cellulaire accru, il faut se demander si la production accrue d'ATP et de G6P dans ces cellules n'est qu'une conséquence de l'augmentation des niveaux de HK en surface de la cellule ou si ces cellules ont des besoins énergétiques réellement plus importants, obligeant alors la cellule à augmenter le contenu mitochondrial de HK afin de fournir l'ATP et le G6P nécessaire à son bon fonctionnement.
La spécificité du CTZ pour les isoformes de HK
Tel qu'introduit précédemment, l'ajout du CTZ, un agent antifongique utilisé dans le traitement d'infections fongiques cutanées, entraîne le détachement de HKII depuis la mitochondrie et perturbe donc ses fonctions protumorales. Préalablement à l'utilisation du CTZ dans le traitement du cancer chez l'humain, son action biologique a été évaluée chez différentes lignées de cellules tumorales. Les résultats ont montré une diminution de la prolifération/survie cellulaire chez des lignées cellulaires de mélanomes de souris (B 16F10), de cancer du poumon (LL/2), de carcinome du côlon (CT-26) [131] et de cancer du sein (MCF10A, MCF-7 et MDA-MB-231) [132]. Par ailleurs, les résultats obtenus en laboratoire démontrent aussi un effet du CTZ sur la survie des cellules, mais cette fois en fonction d'un traitement au H2O2. À ces données s'ajoutent celles rapportées dans ce mémoire, indiquant que l'ajout du CTZ, à des doses n'affectant pas la survie cellulaire, entraîne un détachement préférentiel de HKI, mais pas de HKII, des mitochondries et que ce détachement corrèle avec la résistance des cellules d'hépatome sans K8/K18 au H2O2. A notre connaissance, il n'y a aucune littérature sur l'action du CTZ sur la liaison de HKI à la mitochondrie. Cependant, HKI et HKII étant liés à la mitochondrie par un mécanisme similahe, soit la liaison du groupement N-terminal de la protéine à la membrane mitochondriale [77], il est possible que la liaison de HKI à la mitochondrie puisse être affectée par le CTZ. De plus, les doses de CTZ utilisées dans les essais n'étant pas
suffisantes pour affecter à elles seules la survie cellulaire, il est possible qu'elles ne puissent pas affecter la liaison de HKII en surface de la mitochondrie, mais qu'elles soient en mesure de détacher HKI, permettant de diminuer la résistance des shK8b au stress oxydant. À noter, Furtado et al. ont montré que le CTZ agit directement sur l'activité kinase de HKII pour diminuer la prolifération et la viabilité de lignées cellulaires de cancer du sein humain en diminuant la conversion du glucose en G6P [132]. Il est donc possible que ce mécanisme d'action soit aussi impliqué dans l'augmentation de résistance observée chez les shK8b lors du traitement au H2O2. Ainsi, bien que les résultats démontrent clairement un rôle des HK dans la résistance des cellules hépatocytaires sans kératine au stress oxydant, il est difficile de conclure au(x) mécanisme(s) exact(s) menant à cette augmentation de résistance et à l'effet spécifique de HKI et de HKII dans la résistance au stress oxydant.
La PKC, les mitochondries et la résistance au stress oxydant
Tel que mentionné précédemment, les résultats obtenus par le laboratoire montrent que les PKC, plus particulièrement la PKCÔ, sont impliquées dans le processus de résistance cellulaire au H2O2 [61]. L'inhibition des PKC nouvelles et conventionnelles par le BIM permet d'augmenter la résistance des H4ev au stress oxydant à un niveau se rapprochant de celui des shK8b, alors que l'inhibition des PKC conventionnelles par le Gô n'augmente pas cette résistance. De plus, l'absence de K8/K18 modifie la distribution de la PKCÔ en surface de la mitochondrie suivant un stress oxydant, la quantité de PKCô y étant diminuée en absence de K8/K18, résultat confirmé par l'enrichissement de mitochondries suivant un stress oxydant excessif. Cette diminution d'association de la PKCÔ à la mitochondrie explique donc, en partie, la résistance des cellules sans K8/K18 au stress oxydant. Ces résultats, ainsi que ceux présentés dans ce document, indiquent qu'il y a une perturbation importante de la localisation de certaines protéines en surface de la mitochondrie en absence de K8/K18, autant des protéines pro-survie cellulaire, telle que HK, que pro-mort cellulaire, telle que PKCÔ, et que cette perturbation mène à une augmentation de la résistance cellulaire au stress oxydant.
Perspectives
Les PI3K/Akt, PKC et HK: Les résultats obtenus démontrent une implication des K8/K18 dans la régulation de la réponse cellulaire au stress oxydant. Cette régulation semble passer par une modulation de la réponse mitochondriale dans le processus de mort cellulaire, affectant les protéines en surface de la mitochondrie, telles que PKCô et les HK. Dans ce contexte, il serait très pertinent de savoir comment les kératines affectent l'interaction de ces protéines avec la mitochondrie. Les deux avenues sont l'étude des voies PI3K/Akt et des PKC, qui, telles que décrites précédemment, peuvent affecter l'interaction des HK en surface de la mitochondrie. Puisque des perturbations du métabolisme et de la réponse à l'insuline en absence de kératine ont été observées [124], il est nécessahe de comprendre si et comment les kératines affectent la voie PI3K/Akt connue pour jouer un rôle à la fois dans le métabolisme et le stress oxydant. Tel que démontré, l'absence de K8/K18 affecte légèrement à la baisse le contenu intracellulaire en Akt alors qu'elle augmente la phosphorylation de celle-ci suivant un stress oxydant important. Bien que ces modifications semblent non significatives, leur rôle dans l'augmentation de la résistance des cellules sans K8/K18 reste à déterminer.
La dynamique mitochondriale et la mort cellulaire: Comme mentionné précédemment, la structure mitochondriale peut elle aussi affecter le processus de mort cellulaire lors d'un stress oxydant excessif. Des données recueillies par le laboratoire montrent une modification significative de la morphologie mitochondriale chez les hépatocytes sans K8/K/18, les mitochondries étant plus allongées (résultats non publiés). En considérant ces données, il est possible que la morphologie des mitochondries joue un rôle dans la résistance augmentée des shK8b au stress oxydant, en plus de jouer un rôle dans le métabolisme augmenté chez ces cellules. Il est réaliste de penser que l'augmentation de HK en surface de la mitochondrie puisse être reliée à des demandes métaboliques plus importantes de la cellule sans K8/K18, mais il se peut aussi qu'une activité et/ou une présence augmentée de l'ATP synthase à la mitochondrie permettent une liaison plus facile de HK à celle-ci par la disponibilité de l'ATP plus importante à la mitochondrie. Le lien entre l'action de HK et une présence ou une activité différentielle de PINK1 à la mitochondrie en absence de K8/K18 ne peut non plus être exclu. Ainsi, il est nécessaire de
comprendre la fonction des K8/K18 sur la dynamique membranaire mitochondriale, et donc sur les processus de fusion et de fission membranaire, et sur la dynamique protéinique mitochondriale afin de voir comment les K8/K18 affectent la réponse cellulaire au stress oxydant et, possiblement, le métabolisme cellulaire.
La liaison HK-mitochondrie, le métabolisme, les FI K8/K18 et les pathologies hépatiques La liaison augmentée de HK, en particulier HKII, à la mitochondrie est un processus important dans la tumorigénèse et dans l'effet Warburg. Comme mentionné, ceci confère un avantage indéniable à la cellule tumorale, à la fois en ce qui concerne le métabolisme et la survie cellulaire. Le métabolisme augmenté des cellules tumorales a mené à l'utilisation de techniques permettant la détection de celui-ci dans le diagnostic et le staging de la majorité des tumeurs solides, par exemple en utilisant la tomographic par émission de positrons (TEP) et le 18F-fluorodeoxyglucose (18F-FDG), un marqueur du métabolisme cellulaire, afin de détecter les tumeurs au niveau pancorporel [131]. Chez les cellules cancéreuses, HK inhibe la mort cellulaire en réduisant la libération de cyt c de la mitochondrie. Ce mécanisme a donc mené plusieurs groupes à utiliser cette caractéristique de la protéine afin de trouver des moyens de sensibiliser les cellules cancéreuses à la mort cellulaire. Ainsi, comme décrit précédemment, plusieurs molécules, dont le 3-Br et le CTZ, sont actuellement à l'étude afin de rendre compte de leur efficacité dans le traitement de ces tumeurs par leurs effets sur les HK. En considérant que chez les cellules dépourvues de K8/K18 il y a une augmentation de HK sur la mitochondrie et que des mutations chez la K8 et la Kl 8 sont connues pour prédisposer au développement de pathologies hépatiques, telles que Thépatocarcinome, la caractérisation du rôle de HK dans le métabolisme cellulaire et la réponse à différents stress cellulaires, en particulier le stress oxydant, chez des cellules mutantes pour la K8 et/ou la Kl8, sera nécessaire, et ce autant in vitro que in vivo afin d'évaluer son effet non seulement au niveau cellulaire, mais également au niveau du parenchyme hépatique.
La localisation de HK et la réponse au stress oxydant: Comme discuté précédemment, plusieurs groupes ont démontré que HKII affecte la survie cellulaire par différents mécanismes, que ce soit via sa liaison aux mitochondries ou sa fonction kinase. Cependant, le rôle des HKI et HKII dans la résistance au stress oxydant en absence de Fis K8/K18
n'est pas clair. Bien que les résultats démontrent que la présence des HK en surface des mitochondries soit importante pour augmenter cette résistance, il est impossible d'exclure que la fonction kinase de ces protéines puisse jouer un rôle dans le processus de résistance. Ainsi, d'autres agents pouvant affecter plus spécifiquement la localisation mitochondriale ou la fonction kinase de ces enzymes devraient être utilisées afin de déterminer le mécanisme exact amenant la résistance au stress oxydant via les HK. Certains peptides spécifiques à la partie N-terminale de THKII ont déjà été utilisés par d'autres laboratoires afin de déterminer le rôle exact de la localisation de THK sur la mitochondrie [88,133,134]. Ceux-ci pourraient s'avérer très utiles afin de préciser le mécanisme par lequel une présence des HK en surface des mitochondries mène à la résistance des cellules d'hépatome sans Fis K8/K18 à un stress oxydant.
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